[发明专利]miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途，具体的说是涉及通过检测原发性肝癌组织中miR-885-5p的表达来判断原发性肝癌临床分期的用途，所述诊断试剂通过原位杂交技术实现对miR-885-5p表达量的的检测。本发明的方法属于临床免疫检测方法，特别是运用原位杂交方法检测miR-885-5p从而判断原发性肝癌临床分期的方法。

背景技术

原发性肝细胞癌是常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内是排名第五的恶性肿瘤，世界每年新发现恶性肿瘤病人约635万例，其中肝癌大约占26万例，26万例中42.5%发生在我国且其发病率仍然呈逐年递增的趋势。肝癌发现一般为晚期，有效的治疗方法为肝切除和肝移植，常规化疗对肝癌治疗效果并不明显，所以肝癌的早期诊断尤为重要，探索有效的肝癌临床诊断标记物和治疗策略具有重要意义。而在诊断肝癌的过程中，除了确诊是否患有肝癌外，因为不同临床发展阶段的肝癌治疗措施和预后并不相同，进一步明确肝癌的临床分期同样非常重要。因此研究和开发合适的能够用于准确判断肝癌临床分期分子标记物具有非常重要的现实意义。

microRNAs(miRNAs)是一类含量丰富的非蛋白编码小分子RNA，miRNAs主要是与靶mRNA的3′UTR区域结合,能够抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解,调节多种生物功能。业已表明，肿瘤组织miRNAs表达谱异常与肿瘤的发生发展以及预后密切相关。一些miRNAs，如miR-17-92,可能作为致癌基因；而另一些miRNAs，如miR-15，可作为抑癌基因，它们在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。同时它们在肿瘤干细胞中也发挥着重要的作用。因此miRNAs正成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。

miR-885-5p是一种已知的小分子RNA，NCBI基因库查询显示该基因定位于3号染色体的p25.3的10411173-10411246区间（负链），由Berezikov E等克隆测序发现。现有的报道发现其与神经母细胞瘤的增殖密切相关。我们首次发现miR-885-5p在肝癌和肝炎、肝硬化病人的血清中的表达量远远高于正常对照组，由此推断得出miR-885-5p的表达异常可能和肝病的发病进程有关。

发明内容

本发明通过研究发现miR-885-5p随着肝癌临床分期的增加，表达量明显降低，miR-885-5p可以作为判断肝癌临床分期的诊断标记物，通过生物领域常用的检测方法对肝癌组织中miR-885-5p的含量进行检测能够间接判断肝癌的临床分期。

本发明通过采用生物领域常见的原位杂交方法来检测病理组织中的miR-885-5p分子，以此判断肝癌的临床分期。具体来讲就是，通过对病理组织的原位杂交，检测该组织中miR-885-5p分子的表达量，根据原位杂交的结果来判断肝癌的临床分期。其技术内容包括：原位杂交和显微镜观察等步骤。

石蜡包埋组织切片的原位杂交方法是本领域已知的方法，一般包括脱蜡、乙醇分级水化、蛋白酶消化、分级脱水、杂交、脱水、透明、封片、镜检等步骤。

本发明还涉及一种检测miR-885-5p的杂交探针在制备用于判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途，其特征在于，所述探针为丹麦公司exiqon的探针miRCURY LNA^TM Detection probe，具体序列为：5’AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3’，其中所述的miR-885-5p杂交探针是经过地高辛标记的探针。使用所述诊断试剂判断原发性肝癌临床分期的步骤如下：

（1）脱蜡和水化，具体步骤如下：

①组织切片置于二甲苯Ⅰ中浸泡5分钟，

②组织切片置于二甲苯Ⅱ浸泡5分钟，

③组织切片置于二甲苯Ⅲ浸泡5分钟，

④组织切片置于99.9%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下，

⑤组织切片置于99.9%乙醇Ⅱ中上下浸泡10下，

⑥组织切片置于99.9%乙醇Ⅲ浸泡5分钟，

⑦组织切片置于96%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下，

⑧组织切片置于96%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟，

⑨组织切片置于70%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下

⑩组织切片置于70%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟，

(2)组织切片置于磷酸盐缓冲液PBS中浸泡2-5分钟。

(3)孵育蛋白酶K，将100μl浓度为15μg/ml的蛋白酶K滴加与组织切片表面，37℃孵育10分钟。

(4)用磷酸盐缓冲液洗处理过的组织切片2次，每次五分钟。