[发明专利]miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途

权利要求书

1.一种检测miR-885-5p的杂交探针在制备用于判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途，其特征在于杂交探针的序列为：5’AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3’。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的miR-885-5p杂交探针是经过标记的探针。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的miR-885-5p杂交探针是经过地高辛标记的探针。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于使用所述诊断试剂判断原发性肝癌临床分期的步骤如下：

（1）脱蜡和水化，具体步骤如下：

①组织切片置于二甲苯Ⅰ中浸泡5分钟，

②组织切片置于二甲苯Ⅱ浸泡5分钟，

③组织切片置于二甲苯Ⅲ浸泡5分钟，

④组织切片置于99.9%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下，

⑤组织切片置于99.9%乙醇Ⅱ中上下浸泡10下，

⑥组织切片置于99.9%乙醇Ⅲ浸泡5分钟，

⑦组织切片置于96%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下，

⑧组织切片置于96%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟，

⑨组织切片置于70%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下

⑩组织切片置于70%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟，

(2)组织切片置于磷酸盐缓冲液中浸泡2-5分钟；

(3)孵育蛋白酶K，将100μl浓度为15μg/ml的蛋白酶K滴加与组织切片表面，37℃孵育10分钟；

(4)用磷酸盐缓冲液洗处理过的组织切片2次，每次五分钟；

(5)组织切片脱水，具体步骤如下：

①组织切片置于70%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下，

②组织切片置于70%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟，

③组织切片置于96%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下，

④组织切片置于96%乙醇Ⅱ中浸泡1分钟，

⑤组织切片置于99.9%乙醇Ⅰ上下浸泡10下，

⑥组织切片置于99.9%乙醇Ⅱ浸泡1分钟；

(6)探针与miR-885-5p的杂交，将杂交液（50nM）100μl滴加在组织切片中，将其放入湿盒中，55℃孵育1小时；

(7)SSC缓冲液洗组织切片，具体步骤如下：

①组织切片置于55℃的5×SSC缓冲液浸泡5分钟

②组织切片置于55℃的5×SSC缓冲液浸泡5分钟，

③组织切片置于55℃的1×SSC缓冲液浸泡5分钟

④组织切片置于55℃的1×SSC缓冲液浸泡5分钟，

⑤组织切片置于55℃的1×SSC缓冲液浸泡5分钟，

⑥组织切片置于55℃的0.2×SSC缓冲液浸泡5分钟；

(8)封闭液封闭,室温静置15分钟；

(9)滴加连有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（1:800）100μl,室温静置1小时；

(10)PBST缓冲液洗3次，每次5分钟。

(11)KTBT缓冲液洗2次，每次5分钟。

(12)去离子水洗2次，每次1分钟。

(13)核固红100ml滴加于组织切片上染核,室温静置10分钟。

(14)流水洗组织切片10分钟。

(15)脱水、透明，具体步骤如下：

①组织切片置于70%乙醇中浸泡30秒，

②70%乙醇中浸泡1分钟，

③组织切片置于96%乙醇中上下浸泡10下，

④组织切片置于96%乙醇中浸泡1分钟，

⑤组织切片置于99.9%乙醇Ⅱ上下浸泡10下，

⑥组织切片置于99.9%乙醇Ⅲ浸泡1分钟；

⑦二甲苯Ⅱ中浸泡5分钟，

⑧二甲苯Ⅰ浸泡5分钟；

(16)树脂封片、镜检。

5.一种通过原位杂交技术判断原发性肝癌临床分期的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1-3中任意一项权利要求所述的检测miR-885-5p的杂交探针和原位杂交使用的其他常用试剂。