[发明专利]一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别方法。

背景技术

糖类物质是一种广泛存在于机体中的生物分子，在生物体内起着多种重要的作用。糖类物质主要是以糖类复合物的形式存在，如糖脂，糖蛋白，蛋白聚糖，肽葡聚糖，脂多糖等。其中蛋白质糖基化广泛分布于细胞表面和细胞外基质中，其上的糖链结构与很多的重要的生物功能相互关联，主要涉及调节蛋白的构象和稳定性，控制蛋白质甚至细胞的半衰期。另外，这些糖链结构作为配体的特异性结合介导蛋白的靶向识别，细胞与细胞以及细胞与胞外基质相互作用。生物体中的糖蛋白一般包括多个糖基化位点，而其每个糖基化位点的糖链结构具有其特异的糖型。因此鉴定糖蛋白上所有的糖链结构是非常具有挑战性，其中包括鉴定糖蛋白上的糖基化位点，分析每个糖型结构中的糖链组成，糖链序列，分支类型以及糖链残基中的羟基基团与其他残基的连接方式。现在没有一种技术可以完全得到糖蛋白糖基化修饰所有信息，只有将多种方法联合起来，如多种质谱技术联合，再加上糖链生物合成通路特点才能得到糖链的信息。

糖链分离和分析的方法在最近几年也得到长足的发展。通常，糖蛋白或者糖脂上的糖链通过酶解或者化学反应的方法释放，例如用PNGase F可以释放几乎所有的N-连接糖链，对于O-连接糖链，由于没有像PNGaseF一样具有普适性且留下质量标签的糖苷酶，一般通过化学方法进行切除，如β-消除反应可以释放所有的O-连接糖链。O-连接型糖链与氨基酸Ser或Thr的侧链羟基相连，初始单糖以GalNAc为主这类糖蛋白又称mucin类糖蛋白。另外还有一类O-连接糖型O-GlcNAc，其功能和研究领域与mucin类都有所区分，常独立归为一类。在现有所有基于β-消除反应原理的方法中，在进行β-消除反应之前，避免蛋白前期处理中所残留的各种盐类和杂质对β-消除反应效率的影响，都不可避免地需要对蛋白做除盐处理，这无疑增加了样品损失与操作复杂性。从糖蛋白或者糖脂上释放的糖链需要进行除盐处理，并且要将其从酶，化学反应物以及多肽或者脂类物质等非糖类物质中分离出来，现有的方法主要有特异亲和方法，反相高效液相色谱法，亲水色谱或者是多维联合分离等。这些方法的主要缺点是不能完全将糖链和其他物质分离，特别是亲水色谱法无法将亲水性多肽和盐类等物质与糖链分离。

发明内容

本发明提供了一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，以解决现有技术反应效率较低、可鉴定的糖链种类较少的问题。

为实现以上发明目的，本发明给出以下基本技术方案：

一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，包括以下步骤：

（1）蛋白样品的预处理

取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液。

（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全O-连接糖链分离

将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中（用以使蛋白充分变性），离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；加入1M NaBH₄/0.05M NaOH溶液（即NaBH₄和NaOH的混合水溶液，其中NaBH₄的终浓度为1M，NaOH的终浓度为0.05M）；再经过40～50℃水浴后，离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，即得到已分离的糖蛋白全O-连接糖链；再用冰醋酸调节pH值至中性后，冷冻干燥备用。

基于以上基本技术方案，为取得更佳的技术效果，还可以对方案进一步改进、限定，如：

上述所有的超滤管均采用10KD滤膜，效果最佳。

上述步骤（1）所述的弱碱性清洗液采用40mM NH₄HCO₃或者NH₄AC（醋酸铵）溶液。