[发明专利]一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链及其鉴别方法

权利要求书

1.一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，包括以下步骤：

（1）蛋白样品的预处理

取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；

（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全O-连接糖链分离

将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中，离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；加入1M NaBH₄/0.05M NaOH溶液（即NaBH₄和NaOH的混合水溶液，其中NaBH₄的终浓度为1M，NaOH的终浓度为0.05M）；再经过40～50℃水浴后，离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，即得到已分离的糖蛋白全O-连接糖链；再用冰醋酸调节pH值至中性后，冷冻干燥备用。

2.根据权利要求1所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：所有的超滤管均采用10KD滤膜。

3.根据权利要求2所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（1）所述的弱碱性清洗液采用40mM NH₄HCO₃或者NH₄AC溶液。

4.根据权利要求1至3任一所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中所述反应缓冲液采用10～100mMNH₄HCO₃或NH₄AC溶液。

5.根据权利要求4所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中所述加入超纯水至超滤管中后离心并收集流出液的操作，重复一次。

6.根据权利要求5所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全O-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中，除最后一次离心操作是在离心机中12,000g离心外，其他的离心操作均是在离心机中14,000g离心；所述振荡混合均是在550rpm的恒温振荡孵育器中进行。

7.对按照权利要求1所述方法分离得到糖蛋白全O-连接糖链样品进行鉴别的方法，包括以下步骤：

（1）糖链除盐处理

准备Sepharose 4B：加Sepharose 4B至离心管中，再向该离心管中加入体积比为1:1的甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；再向离心管中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；

向糖蛋白全O-连接糖链样品中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中摇匀，25℃振荡反应；14,000g离心15min弃上清；再加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗至少1次；再加入1:1的甲醇：水溶液摇匀，25℃振荡，12,000g离心15min，收集上清，并冷冻干燥；

（2）分析样品中的全O-连接糖链结构

取50%甲醇溶液完全溶解经步骤（3）处理后的糖蛋白全O-连接糖链样品，点样于MTP Anchorchip 384点的靶板上，真空抽干；再加20mg/ml的基质DHB至样品板上，真空抽干；以反射阳性离子模式鉴定多糖，一级质谱方法参数如下：离子源1，7.50KV；离子源2，6.75KV，反射电压1，29.5KV；反射电压2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；激发光源为N₂激光，分子量检测范围为700-6800；检测时每个样品在多点采集图谱，每个图谱扫描1500次，最后将所有谱图叠加得到最后的多糖一级图谱；

（3）复杂糖链样品的MALDI结果分析

采用SimGlycan 4软件，选择目标离子分析其一级图谱，分析参数为：选择前体离子分子量，电荷状态，阳性离子化模式，加和Na⁺，离子容忍度为1，无化学衍生化，无还原端修饰；分析后得到可能的糖链结构，选择其中得分最高即最可能的糖链结构，结果用Glycanworkbench并标注于图中。