[发明专利]一种用于扩增短链RNA的引物及其相关方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测领域，特别涉及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中检测全长为18-25nt的成熟miR所用的反转录引物的设计与应用技术领域。

背景技术

成熟miR是最近发现的一类全长为18-25nt的单链小分子非编码RNA，是由茎环结构的转录前体(包括pri-miRNA约1000bp、pre-miRNA约60-70bp)加工而成。2011年11月Sanger miRBase数据库（18.0版）公布，发现了2万多种转录本，包括人类的近2000种。miRNAs是Victor Ambros及其同事首先在线虫体内发现的，是一类非编码的内源性单链小分子RNA。其5`端的2-8nt种子区域（seed region）可与其靶mRNA的3`UTR以Waston-Crick碱基全部或部分互补配对（Watson-Crick basepairing），从而发挥转录调控作用。人们预测大约30%的人类基因受miRNAs的调控，每种miRNA调控大约200种靶基因，而每种基因又受多种miRNA调控。各项研究亦表明它参与了人体重要的生物学进程，如发育、造血、器官形成、细胞分化、凋亡和增殖、癌症发生等。随着对miRNAs研究的日趋深入，众多的研究数据显示超过50%的miRNAs基因位于癌基因或脆性基因区域，发挥着癌基因或抑癌基因的作用，在多种癌症中表达上调或降低。

第一篇有关miRNA的论文发表于1993年，随后的十年间相关的研究论文相当有限，然而近5-6年来有关miRNA的研究论文数成倍增加，2010年大约就有近12000篇论文公开发表并且有文献表明，成熟miRNA具有组织特异性、疾病特异性、存在于外周血且非常稳定。因此，miRNA不仅有治疗价值而且有诊断价值。miRNA已经成为广大学者研究的热点，并逐渐向应用领域转化。如何进行准确、特异地检测miRNA成为首先要解决的问题。虽然miRNAs是一类表达相对丰富的转录本，但他们在不同物种和组织中的表达水平变化非常大。低丰度的miRNAs，通常用克隆、northern blot和芯片的技术将难以检测。如果要精确和定量检测miRNA尤其是低丰度miRNA，qRT-PCR技术无疑是最佳选择，因为实时荧光定量PCR技术是检测基因表达的金标准。1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。

PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：

1.变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；

2.退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；

3.延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。

以上三步为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR（RT-PCR）用于RNA的扩增，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。

应用PCR技术检测有一定长度（如100bp到几个kb）的DNA或RNA，初学PCR的技术人员也不会有多大的困难，但是如何设计长度只有18-25nt的成熟miRNA的反转录引物、特异性的正向引物、标记染料的TaqMan探针和反向引物是解决miRNA定量RT-PCR检测的关键所在。因为普通引物的理想长度在15-30bp之间，按照常规的做法一条成熟miRNA的长度就几乎为引物链覆盖了，这样扩增将难以实现。目前解决这一问题的是美国的AB公司，她采用了一种茎环引物反转录成熟miR，来加长转录后的cDNA，实现PCR扩增检测的目的。

在中国专利文献库检索也没有相关文献。

发明内容