[发明专利]一种用于扩增短链RNA的引物及其相关方法

权利要求书

1.一种用于扩增短链RNA的引物，其引物共4条，分别为茎环反转录引物、特异性正向引物、通用反向引物和通用探针，其特征是：茎环反转录引物由5段不同长度的寡核苷酸组成，3`端的6-8bp组成第一区域与靶miR的3`端形成特异性互补，决定转录的特异性，第二区域（2）和第五区域（5）互补结合，形成引物内部双链结构，其Tm值应高于反转录最适温度2-5℃，在反转录的过程中始终保持双链形式，靠近核苷酸环状结构5`端的第四区域（4）设为通用反向引物区，其Tm值接近特异性正向引物或略高于3-10℃，靠近核苷酸环状结构3`端的第三区域（3）设为通用探针区，探针区的GC含量一般大于70%，保证探针的长度不超过20bp且Tm值高于特异性正向引物的Tm值3-10℃，第三区域（3）与第四区域（4）之间应至少间隔3bp以上。

2.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的茎环反转录引物，其3`端和5`端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，并且3`端还有一段6-8个核苷酸的单链结构，该单链与成熟的靶miR特异性互补配对。

3.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5℃。

4.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的特异性正向引物，其Tm值小于通用探针和通用反向引物Tm值3-10℃。

5.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的通用反向引物，其序列与茎环反转录引物的通用反向引物区序列一致。

6.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的通用探针，其序列与茎环反转录引物的通用探针区序列一致。

7.一种采用权利1-6的任意一种引物扩增短链RNA的方法，其特征在于：

茎环反转录引物在合适的温度和反转录酶的作用下与靶miR的3`端特异性结合，并反转录成cDNA第一链；

特异性正向引物由3`端的特异性序列（7）和5`端的尾部序列（8）构成，通用反向引物由茎环引物的通用反向引物区序列构成，通用探针由茎环引物的通用探针区序列构成；

经过充分预变性后，当退火温度达到特异性正向引物特异性序列（7）的Tm值时，特异性正向引物与cDNA第一链（6）的3`端特异性结合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二链（9）；

再变性后，cDNA第二链9与cDNA第一链6解链成单链，当退火温度达到通用反向引物和通用探针Tm值时，通用反向引物和通用探针与cDNA第二链（9）配对结合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二链（9）为模板延伸形成cDNA第二链（9）的互补链，同时当延伸到通用探针时，通用探针被水解，通用探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发出荧光，实现定量检测。

8.如权利要求7所述扩增短链RNA的方法，其特征在于所述茎环反转录引物其3`端和5`端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，该互补双链的Tm值应大于反转录最适温度2-5℃。

9.如权利要求7所述扩增短链RNA的方法，其特征在于所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5℃。

10.如权利要求7所述的扩增短链RNA的方法，其特征在于：所述cDNA第二链的合成的退火温度为60-65℃，PCR扩增循环的退火温度为65-70℃。