[发明专利]多肽内二硫键的定位方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽结构的测定方法，尤其涉及多肽内二硫键的定位方法。

背景技术

当一条多肽链中含有多个半胱氨酸且形成多对二硫键时，其侧链巯基可能有多种连接方式，如何确定巯基的配对方式是多肽研究领域非常重要的一项技术。在已发表的文献和专利中，多肽内二硫键的定位主要有以下几种方法：1）酶切法、2）对角线电泳法、3）部分还原结合Edman降解法，Edman降解测序，该方法费时、费力，且分析结果不稳定。4）X射线晶体衍射法、5）二维核磁法等，而部分还原法联合MS/MS进行多肽内二硫键定位的方法还未见报道。

发明内容

本发明提供一种定位多肽内二硫键连接结构的方法，包括以下步骤：

1）制备部分还原产物：将待测多肽与二硫苏糖醇在高温下孵育10-60min,优选20-40min，加入TCEP反应5-60min,优选20-30min；分离得到部分还原产物； 

2）制备烷基化的部分还原产物：将部分还原产物与碘乙酰胺在高温下反应5-60min，优选10-20min，使二硫键断开部位的巯基烷基化；分离得到烷基化的部分还原产物；

3）断开所有二硫键：将烷基化的部分还原产物与二硫苏糖醇在45-55℃反应5-60min，优选20-30min，使烷基化的部分还原产物中所有二硫键断开；

4）：用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱和电喷雾-四极杆-飞行时间质谱，采用纳喷技术结合碰撞诱导解离方法对断开所有二硫键的烷基化多肽进行检测分析，根据氨基酸被烷基化的情况以及多肽的以及一级结构定位二硫键连接结构；

所述的高温指35-75℃，优选55-65℃。

步骤1）制备部分还原产物：

所述的待测多肽是指肽链内具有二硫键结构的多肽；这些“部分还原产物”有一对、二对、三对……或更多对二硫键被还原；之所以称为“部分还原产物”是由于测定所需要的产物不是完全被还原或完全未被还原的多肽，而是只有部分被还原的多肽，二硫键是处于断开的状态，比如多肽中含有3对二硫键，部分还原产物为一对二硫键或二对二硫键被还原的产物，部分被还原的产物是指2种物质，而不包括三对二硫键全部被还原的产物，也不包括一对都未还原的多肽原始结构。

实践中发现，控制待测多肽处于部分还原状态是技术难点，本领域的技术人员难以掌握其中的诀窍。申请人研究发现，控制待测多肽完全被还原而处于部分被还原的状态，需要控制还原剂的用量和反应时间。所以经过申请人经过创造性的劳动确定影响还原的因素如下：

待测多肽与二硫苏糖醇的用量质量比为：1:2-1:4。申请人发现二硫苏糖醇可以将包裹在空间结构内部的二硫键打断。

所述的孵育是指在一定温度条件下进行反应的过程，是实现二硫键断裂的过程。

待测多肽与三羧乙基磷（TCEP）的用量质量比为：2:1-4:1。

控制TCEP的用量，从而达到部分还原的效果，为后续测定提供3对、2对及1对二硫键被还原的产物。本发明联合应用二硫苏糖醇与TCEP，该方法可以将包裹在多肽空间结构内的二硫键打开，同时通过控制还原剂的量和反应时间，又保证其二硫键不会被全部还原。

当反应能够符合测量目的后，可以采用三氟乙酸（TFA）终止反应，待测多肽与三氟乙酸的用量质量比为：30:1-10:1

分离反应产物优选采用色谱法，更有选采用高效液相色谱法，即采用HPLC。比如：采用HPLC法分离得到二硫键断开的部分还原产物， HPLC分离体系可以为：A相：0.1-0.2%TFA，B相：ACN。

每断开一对二硫键，原样分子量增加2Da（Da是分子量单位道尔顿），所有部分还原产物可以经质谱确认。

步骤2：部分还原产物烷基化

部分还原产物量未知，无法计算与碘乙酰胺用量比，经过申请人摸索发现，当每100μL部分还原产物加入20-30μL 1.0M碘乙酰胺溶液时可实现本发明的技术效果。故碘乙酰胺的用量可以根据反应规模进行换算。

申请人检测烷基化的部分还原产物与碘乙酰胺具有一定的量比关系，质量比为：1:2-1:3。

当反应能够符合测量目的后，可以采用三氟乙酸（TFA）终止反应，待测多肽与三氟乙酸的用量质量比为：1:200-1:300

分离反应产物优选采用色谱法，更有选采用高效液相色谱法，即采用HPLC。比如：采用HPLC法分离。

每个巯基与碘乙酰胺完成烷基化反应后，分子量增加116 Da，烷基化的部分还原产物可以经质谱确认。