[发明专利]一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法

说明书

技术领域

本发明涉及间充质干细胞和成纤维组织的培养技术。

背景技术

现有的间充质干细胞分泌素的美容产品(如苹果干细胞)已经为大众所接受,而且学术界对于来自间充质干细胞的分泌素的潜在医疗用途正展开深入的探讨，近年已有分泌素的正面医疗效果的文献出现,如改善皮肤皱纹,心衰竭,脑退化,视力,寿命延长,等等。近年有大量文献亦指出分泌素的其它潜在医药价值,暂时研究得最深入的便是其改善心脏衰竭的功用,研究指出干细胞分泌物中所含的外吐小体(exosome)具有一定医疗用途如美国专利2011/0003008A1所揭示的。

现有技术中，医院主要从病人的骨髓提取组织去培养出间充质干细胞，其方法是：首先通过手术获取骨髓组织，然后用胶原蛋白酶消化骨髓组织,将离心后所沉淀出来的细胞团利用磷酸盐缓冲液进行清洗，之后将细胞置于含有细胞培养液的培养瓶中培养以提取间充质干细胞，数天后更新细胞培养液,提取到的间充质干细胞便会附在培养瓶的壁上继续生长。现有成纤维细胞的提取是主要从耳背提取皮肤组织(约5mm x 5mm x 2mm),然后再将提取得到的皮肤组织采用上述骨髓组织相同的提取方法进行处理得到。

现有技术的缺点主要表现为：

1）间充质干细胞和成纤维组织需要分别从不同的活体组织中提取和培养，培养复杂度大；

2）间充质干细胞和成纤维组织的提取源组织需要进行手术，如骨髓组织的提取，提取过程需要进行手术，给身体受到严重创伤(如严重烧伤)不能接受手术提取体内组织(如骨髓,脂肪)的病人带来限制；而成纤维细胞的提取会在客人的耳背抽取约5mm x 5mm x 2mm的皮肤组织(参看美国专利US 5,665,372),造成可能会形成疤痕的伤口；

3）手术提取得到骨髓组织的存活时间短，需要马上进行间充质干细胞的提取工作，给培养带来了时间和地域上的限制；

发明内容

本发明为克服上述现有技术的缺点，提供一种更为安全、更为简单的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维细胞的方法。

本发明实现发明目的采用的技术方案是，一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，所述培养方法包括以下步骤：

a．从活体牙龈中抽取牙龈组织，将牙龈组织置于组织保持液中保存，所述组织保持液包含有MEM培养基底液、牛血清、抗生素和抗真菌素；

b．以磷酸盐缓冲液对所述牙龈组织进行清洗,再加入胶原蛋白酶对所述牙龈组织进行消化；

c．对消化后的混合液进行离心分离，得到细胞团；

d．将上述细胞团置于含有MEM培养基底液的培养瓶中培养，收集培养得到的细胞并将所述细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中；

e．在步骤d的磷酸盐缓冲液中加入带有磁铁的成纤维细胞抗体，混合后静置反应；

f．将步骤e反应后的产物置于磁化细胞分离器的分离管中，加入磷酸盐缓冲液进行分离，收集磁化细胞分离器的洗脱物即为间充质干细胞；

g.取出所述分离管，加入磷酸盐缓冲液到分离管中,利用柱塞将分离管中的细胞压出，收集得到的细胞即为成纤维细胞。

优选地，其特征在于，所述组织保持液包含有MEM培养基底液、体积分数为5-20%的牛血清、80-120U/ml的抗生素和0.25-2.5ug/ml抗真菌素。

优选地，所述步骤b中胶原蛋白酶的浓度为50-100U/ml。

优选地，所述步骤c中，离心的转速为1000-2500rpm,离心时间为3-5分钟。

优选地，所述步骤d中利用质量体积比为0.2-0.3%的胰蛋白酶或dispase分散酶收集培养得到的细胞。

优选地，所述步骤e中成纤维细胞抗体的加入量为10-30ul每四百万颗细胞。

优选地，所述步骤f中还包括，重复加入磷酸盐缓冲液进行分离，再收集洗脱物。

优选地，所述步骤g中还包括，重复加入磷酸盐缓冲液到分离管中,利用柱塞将分离管中的细胞压出，收集得到的细胞即为成纤维细胞。

优选地，所述步骤g后还包括，将收集到的间充质干细胞和成纤维组织分别置于含有细胞培养液的培养瓶进行培养，得到目标数量的间充质干细胞和成纤维组织。

本发明的有益效果是：

1）本发明通过一种源组织（牙龈组织）即可同时提取和培养出间充质干细胞和成纤维细胞，具有方法简单，安全的优点；