[发明专利]三元表达元件、包含该元件的真核表达载体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体涉及一种三元表达元件，含有该元件的真核表达载体，其通过实现目的基因、二氢叶酸还原酶（DHFR）基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的连锁表达，可方便地建立和筛选稳定高表达细胞株。

技术背景

自20世纪70年代基因工程兴起以来，基因表达已经渗透到生命科学研究的各个领域，成为不可或缺的一种关键技术。基因表达包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核表达系统是目前应用较广泛的技术平台，已成功应用于基因功能研究和蛋白药物生产。表达载体是真核表达系统的重要组成部分，构成了真核表达系统的基础。真核表达载体含有许多功能不同的基因元件，比如启动子、筛选基因和复制原点等，这些不同的基因元件决定了载体操作的具体过程和条件。

真核表达包括瞬时和稳定表达。瞬时表达时，目的基因不整合到宿主基因组中，独立于宿主基因组而大量转录和翻译，从而实现短暂的高水平的表达，可以在24-96小时内检测到目的基因的表达。瞬时表达可以方便快速地得到少量的蛋白，用于前期的活性筛选或验证，便于探索性基础研究。但是瞬时表达载体随着宿主细胞的分裂而逐渐丢失，无法实现长久持续的基因表达。在许多情况下，维持长久持续的目的基因表达是必需，这就需要借助于稳定表达。稳定表达时，目的基因可以整合到宿主基因组中，能够随着宿主基因组的复制而复制，目的基因不随宿主细胞的分裂而丢失，因而可以实现持久稳定的表达。近几十年来，随着对重组蛋白药物的需求越来越大，稳定表达技术发展也日新月异，已经被广泛用于重组蛋白药物的开发。

在建立稳定表达细胞株时，经常需要借助某些筛选标志，比如新霉素抗性基因（neomycin resistance gene，Neo R）。Neo R基因所编码的氨基糖苷磷酸转移酶能够分解新霉素的类似物G418。真核细胞对G418敏感，在含有G418的生长环境下无法长时间生存，而只有其基因组整合了外源Neo R基因的细胞株才能够在含有G418的生长环境下长期生存，因此Neo R基因可以作为真核细胞的稳定筛选标志，被许多用于稳定表达的真核表达载体所应用。

在目前的许多上述载体中，目的基因与Neo R基因各自拥有独立的启动子，分别表达目的蛋白和氨基糖苷磷酸转移酶。在此种情况下，由于表达载体整合入宿主基因组是采用随机重组方式，因此可以发生只有Neo R基因成功整合，而目的基因未能成功整合的现象，因此就会导致出现G418耐药、但目的基因不表达的所谓假阳性细胞克隆。这种假阳性细胞克隆由于只表达Neo R基因而不表达目的基因，因此细胞代谢的压力比Neo R基因和目的基因都表达的真阳性细胞克隆小很多，因此在用G418筛选的时候，假阳性细胞的生长速度远远超过了真阳性细胞，最终导致真阳性细胞被抑制或稀释，造成稳定筛选的失败。因此，如何提高筛选的成功率一直是建立稳定细胞株所面临的难点。

此外，真核表达的另外一个挑战就是表达量较低。不同于原核表达载体可以在宿主内独立大量复制和转录，真核稳定表达通常借助整合在宿主基因组中的基因元件而实现表达。但是在建立真核稳定表达细胞株时，外源基因的整合位点是相当少的，可用于基因转录的拷贝数远远低于真核宿主，因此这就决定了真核稳定表达水平通常都比较低，这就必须要继续进行下一步的高表达细胞株筛选。而且，筛选高表达的目的细胞株是一个比较繁琐的过程，一般需要借助于ELISA和免疫印迹等方法。这种方法需要采集培养细胞的培养基，检测培养基中目的蛋白的水平，以此来作为选择高表达细胞株的参考，此过程需要的时间和人力往往较大。并且，在选取阳性细胞克隆的时候，也要面对数量众多的备选细胞，使得选取过程也相当繁琐。

因此，面对以上种种问题，需要开发一种新型的真核表达载体，这种载体不但可以用于高表达目的基因，也适于方便地监控和筛选阳性细胞。

发明内容

本发明针对建立稳定高表达细胞株时存在的两个问题，即筛选困难和表达量低，开发了一种新型的三元表达元件及表达载体，可以较好地解决上述难点。

本发明的三元表达元件，为将多克隆位点MCS、二氢叶酸还原酶编码基因DHFR及增强型绿色荧光蛋白编码基因EGFP通过内源性核糖体进驻位点IRES串联得到的连锁表达元件。

其中，本发明所述连锁表达元件的结构为MCS-IRES-DHFR-IRES-EGFP或MCS-IRES-EGFP-IRES-DHFR。

其中，上述的三元表达元件的核苷酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；