[发明专利]旋毛虫与乳腺癌相关抗原基因TS498抗体制备方法

说明书

 

技术领域：

本发明提供了旋毛虫与MCF-7乳腺癌相关抗原基因TS498蛋白抗体及其制备方法，本发明还提供了该蛋白抗体的医用用途，属于生物制药领域。

背景技术：

旋毛虫是一种重要的人兽共患寄生虫，在对其长期研究过程中发现，旋毛虫的感染具有增加宿主抵抗肿瘤的能力。有研究发现旋毛虫活虫、旋毛虫致弱虫、旋毛虫全抗原、旋毛虫可溶性抗原和旋毛虫ES抗原等均具多重抗肿瘤作用。目前发现旋毛虫与肿瘤相关抗原具有抗肿瘤作用，因而旋毛虫与肿瘤相关抗原蛋白抗体也具有抗肿瘤作用。目前未见旋毛虫与MCF-7乳腺癌相关抗原基因蛋白抗体抗肿瘤的报道。

发明内容：

本发明提供了旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因TS498，为一种新的蛋白基因物质，其抗体具有抗肿瘤生物活性。

本发明还提供了该相关基因蛋白抗体的制备方法，适用于工业化生产。

本发明进一步公开了该蛋白抗体的医用用途，用于制备治疗肿瘤的药物。

本发明公开的旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞相关蛋白，其DNA序列如SEQ No.1所示。

本发明相关蛋白抗体的制备方法如下：

分别制备旋毛虫和MCF-7乳腺癌细胞的抗血清，然后分别利用间接ELISA方法确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿瘤细胞阳性血清间是否存在相关抗原；利用western blotting 方法确定与旋毛虫相关的MCF-7细胞抗原的分子量大小，并分离相关蛋白，制备相关蛋白的抗血清。然后利用制备的抗血清对旋毛虫cDNA表达文库进行筛选，得到与MCF-7相关的旋毛虫蛋白基因。克隆并原核表达相关蛋白，纯化复性其原核表达蛋白作为免疫原免疫小鼠，获得相关基因蛋白的抗体。

本发明所述的旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞相关蛋白制备方法，其特征在于引物序列为SEQ No.2：

上游:  5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3',

下游:  5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3'。

本发明所述的旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞相关蛋白制备方法，利用含特定酶切位点的特异性引物扩增TS98基因，引物序列为SEQ No.3：

上游：5’-TCCGAATTCATGCAGGGCTATCGCAGTCC-3’，

下游：5’- GCACTCGAGTCATCTCTTCTGACCAGCCGG 3’。

本发明所述的旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞相关蛋白在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

本发明的积极效果在于：

旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原蛋白抗体能对肿瘤产生强的抑制作用，同时旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原TS498基因蛋白抗体易于制备和工业化。

附图说明：

图1、旋毛虫高免血清和MCF-7乳腺癌细胞粗抗原的交叉反应及其分子量；

图2、TS498基因PCR扩增产物电泳图；

图3、重组克隆质粒pMD18T-TS498的双酶切鉴定（EcoR I/XhoI）；

图4、重组表达质粒pET-28a-TS498的双酶切鉴定（EcoR I/XhoⅠ）；

图5、TS498的原核表达产物的SDS-PAGE 和Western blot分析。

具体实施方法：

实施例1

1.旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞相关蛋白确定

首先制备旋毛虫可溶性抗原和MCF-7乳腺癌细胞抗原并分别免疫家兔和BalB/C小鼠制备两种抗原的阳性血清。用MCF-7可溶性蛋白和旋毛虫可溶性粗抗原作为包被抗原，用兔抗旋毛虫高免血清和鼠抗MCF-7细胞高免血清作为被检抗体，通过建立间接ELISA方法检测旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞间的交叉抗原情况。结果表明，旋毛虫抗原与MCF-7乳腺癌细胞抗血清之间及旋毛虫抗血清与MCF-7乳腺癌细胞蛋白间均存在一定的交叉免疫反应，同时，两种蛋白不与兔和小鼠的健康血清反应。经反复摸索，得到最佳的抗体效价分别为抗旋毛虫高免血清为1:3200，抗MCF-7乳腺癌细胞高免血清为1:6400，同时两种抗原都不与健康小鼠血清反应。

2. 旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞相关抗原蛋白的western bloting分子量的检测