[发明专利]检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体涉及检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接ELISA试剂盒。

背景技术

鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis, IB）是由冠状病毒属的传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus, IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，以引起鸡呼吸道感染、肾炎、产蛋下降为主要特征，可引起幼鸡死亡率高达40%，成年鸡感染后产蛋量下降10%-50%，给世界养鸡业带来重大的经济损失。

鸡传染性支气管炎病毒具有多种血清型和多组织嗜性，自1931年最早报道呼吸型IB以来，随后报道了肾型、肠型、生殖道型、腺胃型等传染性支气管炎，至今已经报道的血清型达30余种，近年来新的血清型和变异株仍不断出现，给流行病学的研究和防疫带来了极大地困难，也给养鸡业造成了严重的经济损失。我国的免疫鸡群和非免疫鸡群均易发生嗜肾型IBV的感染，其中已经报道的有嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株、HF2株等。嗜肾型鸡传染性支气管炎的控制关键之一在于建立快速诊断的方法。分离病毒是诊断本病最经典可靠的方法，但是用时较长，而且常因同时感染的其他病毒影响而漏检；琼脂扩散试验(AGP)操作简单，但是灵敏度低，沉淀抗体持续时间较短，不适合疫苗免疫效果的评价；病毒中和试验(VNT)可以用于检测IB的抗原和抗体，敏感、特异，并可用于病毒的分型，但是实验操作复杂，费时而且昂贵；微量血凝抑制（HI）实验操作简单、快速，易于推广，具有早期诊断的价值，但是鸡传染性支气管炎病毒无自然血凝活性，必须经过特殊处理才可以凝集红细胞，这也限制了HI在IBV抗体检测中的应用；RT-PCR检测方法具有敏感、快速、特异等特点，但是对实验室条件要求高，操作复杂，难以推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒含有高特异性的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体，能够准确、安全、快速、灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒抗体。

本发明的另一目的是提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，该试剂盒含有高特异性的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体，能够准确、安全、快速、灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒。

本发明提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括：已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体、并结合了嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株灭活纯化抗原的酶标板。 

采用如下方法制备所述酶标板：

（a）向酶标板的每孔中分别加入100μL浓度为0.59～9.44 μg/mL的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体溶液，4℃包被过夜；

（b）洗涤；

（c）用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤；

（d）向酶标板的每孔中分别加入100 μL浓度为104.2～208.4μg/mL的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株灭活纯化抗原溶液，37℃孵育1.5 h，洗涤。

步骤（a）中所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体溶液的浓度为2.36 μg/mL。

步骤（d）中所述加入到酶标板每孔中的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株灭活纯化抗原溶液的浓度为138.90 μg/mL。

该试剂盒还包括：

（1）10×洗涤液：pH7.4，体积100 mL；所述10×洗涤液是含有质量浓度分别为5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液；

（2）10×血清稀释液：pH7.4，体积100 mL；所述10×血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液；

    （3）酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25 mL；

（4）底物显色液，包括：

A液：将1 mL浓度为10 mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液加入到100 mL 浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液的配制方法为：0.1 mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7 mL和0.1 mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3 mL混合即成；