[发明专利]检测菌体活细胞的方法及其应用以及引物与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程（技术）领域，具体地，涉及一种检测待测样品中的菌体的活细胞的方法及其在检测肠道内容物的菌体活细胞数中的应用，以及一种特别适用于检测长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）的引物与试剂盒。

背景技术

现有的研究证明，益生菌菌体的死细胞也可在机体中发挥益生功能，但是死细胞不能在胃肠道中定植，一段时间后会随着排泄物被排出体外；而菌体活细胞可定植于胃肠道中并源源不断的分泌益生因子，从而能够对机体发挥更好的益生效果，因此，对益生菌菌体的活细胞的检测尤为重要。

在现有的技术中，一般采用平板计数法检测菌体活细胞数，但是平板计数法操作繁琐且持续时间长，不能快速获得检测结果。而且对于含有多种菌体的样品（如肠道内容物）来说，根本很难利用平板计数法实现特定菌体活细胞的计数。

随着分子生物学的发展，检测技术也得到了突飞猛进的发展，近些年发展起来的分子生物学方法如特异性引物设计技术、杂交探针技术、PCR-ELISA技术、16S RNA技术、TGGE/DGGE技术、RAPD技术和FISH技术，这些技术的发展实现了含有多种菌体的样品特定菌体的定性和定量检测，但是这些方法只能检测样品中特定菌体的总数量，均难以实现特定菌体的活细胞计数。

叠氮溴化丙锭（PMA）和叠氮溴化乙锭（EMA）是两种对DNA和RNA具有高度亲和力的光敏染料。PMA和EMA可选择性的进入细胞膜破损的非活性细胞内部，并与非活性细胞的DNA共价结合，在强光的照射下通过叠氮基团与DNA进一步形成牢固的共价结合，从而抑制其PCR反应，由于PMA和EMA会被阻隔在活性菌体的完整细胞膜之外，使得定量PCR（qPCR）只能检测到细胞壁完整的活菌体，而细胞壁不完整的非活性细胞菌体则无法检测到。以上过程均完成于DNA提取之前，未与DNA结合的游离PMA和EMA在强光的照射下与水分子反应从而被除去，对后续的PCR和DNA测定不会造成影响，最后利用qPCR完成对细菌活细胞的检测。因此，PMA和EMA与qPCR的结合可以成为对活细胞量化分析强有力的工具。然而Nocker等（2006）通过对李斯特菌的研究发现，EMA具有较强的细胞毒性，因而会在很大程度上影响检测结果，所以EMA并不是理想的检测材料；而PMA对各种菌体活细胞的毒害作用及其使用浓度缺乏理论基础，尚待进一步研究。

长双歧杆菌BBMN68菌株（Bifidobacterium longum subsp.longum BBMN68）分离自长寿老人的粪便中，是一株具有良好益生功能的的益生菌，研究发现，该菌株具有良好的耐酸耐胆盐性能、良好遗传稳定性、对机体安全无毒害作用、提高巨噬细胞的吞噬作用、促进小鼠胃肠道消化吸收功能、增强小鼠肠道免疫屏障、调节机体免疫系统、延缓秀丽线虫的衰老等功能，可以看出该菌株对人体健康有着重要的意义，所以研究检测该菌株的菌体活细胞的检测方法特别是试剂盒具有重要的价值。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测待测样品中菌体的活细胞的方法及其应用以及引物与试剂盒。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种检测待测样品中的菌体的活细胞的方法及其在检测肠道内容物的菌体活细胞数中的应用，所述待测样品为含有或不含有上述菌体的活细胞的悬浊液，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将所述待测样品与PMA接触，相对于每ml的所述待测样品，PMA的用量为65-75μg，优选为68-72μg，所述接触包括依次进行暗处理和光处理；对接触后的产物进行提取DNA的操作，得到DNA样品；

（2）在能特异性地使所述菌体的DNA得到扩增的条件下，对所述DNA样品进行PCR扩增的操作，获得扩增产品；

（3）根据所述扩增产品中菌体DNA的扩增产物的量判断待测样品中菌体活细胞的数量，其中，所述菌体DNA的扩增产物的量越多，则指示待测样品中菌体活细胞的数量越多。

另一方面，本发明提供一种引物，其特征在于，该引物包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。