[发明专利]一种籼稻组织培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种籼稻组织培养的方法。

背景技术

利用转基因技术将外源优良基因导入植物是提高作物育种效率的重要途径。然而要开展大规模的转基因育种，必须具备一个良好的愈伤组织增殖和再生效率高的组织培养体系。水稻做为基因组研究的模式作物，遗传转化技术体系比较完善，但多数籼稻品种在愈伤组织继代过程容易褐化，导致分化能力降低，尽管在外植体、培养基成分及培养条件等方面进行了大量研究，但迄今为止，适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立，严重影响了籼稻转基因的研究与应用。

1、基本培养基类型对籼稻愈伤组织分化影响

易自立等人在实验中证明CC培养基对籼稻的分化效果较好。曾桂萍在NB、MS₁、MS₂和NMB四种分化培养基的分化培养的对比实验中，得出以下结果，MS₂培养基是最适合作籼稻分化的培养基，其次是NMB，再次是NB，效果最差的是MS₁。

2、植物激素对籼稻愈伤组织分化的影响

崔广荣等以中籼898成熟种子为材料的研究结果显示，NAA、6-BA的不同浓度组合对籼稻的分化成苗具有显著作用。认为分化培养基中6-BA浓度为1.0mg/L，NAA浓度为0.5mg/L为最好。王亚琴等以籼稻不育系中A的种子为外植体的研究结果表明，添加外源激素3.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA有利于提高其分化率（王亚琴,梁承邺.籼稻不育系中A完善再生系统的研究.中山大学学报（自然科学版）,2006,45(5)：81～84）。

张平等人分析几种不同的激素配比对籼稻愈伤组织分化率的影响。结果表明，在分化过程中，以6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L的激素配方，其愈伤组织的分化率最高。尹福强等的实验结果却认为以6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L的激素配比效果为最佳，其愈伤组织现绿时间早、绿点多、分化频率高（尹福强,刘铭,菜光泽,等.农杆菌介导转化水稻成熟胚影响因素研究.西昌学院学报（自然科学版）,2005,19（4）：37～40）。

高三基等人的实验表明，外加一定浓度的ABA对促进胚性愈伤组织的生长和胚状体发生、发育具有一定作用，从而提高成熟胚愈伤组织的分化率（高三基,陈如凯,马宏敏.影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素.作物学报,2004,30(12)：1254～1258）。

3、微量元素对愈伤组织绿苗分化的作用

铜是植物正常生命活动所必需的微量元素。Yang等研究发现，在培养基中添加各种浓度为对照N6基本培养基的2倍的常量微量元素，结果显示只有铜能明显提高水稻成熟胚培养的愈伤组织植株再生频率（YangYS，ZhengYD，ChenYL，et a1.Improvement of plant regeneration from long term cultured calluses of Taipei309，a model rice varieties in in vitro studies[J]．Plant Cell Tissue Organ Culture，1999，57：199-206）。

袁玲通过研究发现铜、银元素能明显提高水稻愈伤组织绿苗再生，而且使用浓度范围较广（2-20μmol/L），这给籼稻成熟胚培养的实际应用带来了很大的方便。

4、干燥处理对水稻愈伤组织分化的影响

田文忠曾报道干燥处理能提高籼稻愈伤组织的再生频率（田文忠．提高籼稻愈伤组织再生频率的研究[J]．遗传学报，1994，21(3)：215-221）。赵成章等人以浙733、广陆矮4号、中优早2号等3个籼稻品种的成熟胚和秀水11、春江03、宝龙等3个粳稻品种的成熟胚的愈伤组织为试验材料，干燥处理4天后再接种于分化培养基中，发现干燥处理均能提高水稻愈伤组织绿苗分化频率，但各基因型间差异较大。对籼稻的效果比粳稻稍明显（赵成章，吴连斌，杨长登，等．干燥处理对水稻愈伤组织绿苗再生和若干生理生化特性的影响[J]．作物学报，1997，23(1)：39-43）。肖向文等人以籼稻恢复系品种JH35的愈伤组织干燥处理2-5天，使其失水50%左右，再转移到分化培养基中．获得了59.4％的分化率，而对照处理只有43.5%的分化率。因此，在愈伤组织转入分化培养基之前，可采用干燥处理的方式来提高籼稻成熟胚愈伤组织的分化率。

5、不同再生途径对籼稻成熟胚愈伤组织分化的影响