[发明专利]6-GGPP合酶、8-倍半萜合酶、截短侧耳素高产菌株及菌株的应用

说明书

技术领域

本发明涉及截短侧耳素合成酶基因、生产截短侧耳素的菌株及其应用，具体涉及GGPP合成酶、倍半萜合成酶、截短侧耳素的高产菌株、截短侧耳素合成途径及应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

截短侧耳素是化学合成泰妙菌素（Tiamulin）的前体，分子式为C₂₂H₃₄O₅，分子量为378.51，属二萜类化合物是高等真菌担子菌侧耳属Pleurotus mutilus或其它真菌的次级代谢产物，是一种天然的具有广泛抗菌活性的二萜类化合物。截短侧耳素的抗菌机理为抑制感受性细菌蛋白质的合成，即它作用于细菌体内的核糖体，主要表现为抑菌，高浓度时表现杀菌作用。截短侧耳素作为一种常用的兽用抗生素以及半合成前体物质，使用范围相当广泛。从最初的兽用抗生素，到现在结构改造成为人用抗生素，截短侧耳素类抗生素已经逐渐开始受到大量的重视。

然而从截短侧耳素发现到现在，关于截断侧耳素发酵条件的研究相对较少，而文献报道的产物产量仅为2.2mg / ml 左右，产量偏低，不适宜工业化生产。从工业化来看，虽然我国截短侧耳素的产能大，但菌株的效价水平较低，增加了生产的成本。因此迫切需要选育高产截短侧耳素的菌株，优化其发酵条件，以获得大量的截短侧耳素，适于工业化应用。

发明内容

本发明提供了两种对截短侧耳素的形成具有重要影响的6-GGPP合酶（即GGPP合酶、6-GGPP合酶、GGPP合成酶，下同）和8-倍半萜合酶（即倍半萜合成酶、倍半萜合酶、8-倍半萜合成酶，下同），具有这两种酶的菌种产截短侧耳素的效价水平较高。

本发明还提供了两种新的截短侧耳素高产菌株，这两种菌株生产发酵截短侧耳素的效价水平都较高，为截短侧耳素的生产提供了更好的选择。

本发明还提供了该两种高产菌株的应用——即用它们发酵生产截短侧耳素，该菌株效价高、降低了成本，适于工业化大生产。

本发明是通过以下措施实现的：

本发明通过筛选和诱变得到了两种截短侧耳素的高产菌株——斜盖伞属菌株。其中，一种为斜盖伞（Clitopilus prunulus）TM110518，其保藏编号为CGMCC NO.6093，保藏时间为2012年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。该TM110518菌株是从土壤中通过富集和划线分离的方法分离得到的，将所得菌种进行菌种鉴定，方法如下：

形态学特征：

固体培养特征：观察菌种在PDA平板上的生长情况及菌落形态。菌丝在PDA中培养3天后以菌种为圆心向四周延伸，菌丝呈白色，生长浓密。

细胞形态特征：菌丝纤细，宽度均在2.5-3 mm，有横隔，未发现锁状联合．菌丝培养至1个月未观察到孢子的形成．最长观察至3个月，观察不到子实体的形成。 

液体培养特征：在无菌条件下，用接种环挑取一个菌落于液体培养基中，28℃，210rpm摇床培养，该菌在培养基中生长缓慢而均匀，培养基变得更加粘稠，达到最大浑浊度后，菌体会部分沉淀，菌体呈乳白色。

分子鉴定：

菌种送至北京微生物研究所鉴定其rDNA及rRNA，利用近似物种的rDNA序列设计引物并进行PCR扩增，测序结果在Genbank中进行比对．证实该新菌株是——斜盖伞（Clitopilus prunulus）。

TM110518菌种的ITS及28SrDNA（D1/D2）序列如下： 

ITS序列

CCCGTAAACAGTAAGGACGTGAAGATCGGATCATTATTGATAACTTGGTCAAGCTGTTGC 60

TGGTCCTTCGGGGCATGTGCACGCTTGCCACCAAATTTAACCACCTGTGCACCTTTTGTA 120

GACTAGAAACGTTTCTCGAGGCAACTCGGATTGAGAATTGCTGCGCGAAAGCCAGCTGTT 180

CTTGTGTTTCTCAGTCTATGTTTTTACATACCCCGAATGAATGTATTAGAATGTATTGCT 240

GGGCCTTTGTGCCTTTAAATCAAATACAACTTTCAACAACGTGAATCATCGAATCTTTGA 300

ACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCT 360