[发明专利]三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫检测方法（Single-reagent Polarization Fluoroimmunoassay, SRPFIA）。

背景技术

三聚氰胺（Melamine）（化学式：C₃H₆N₆），俗称密胺、蛋白精，国际理论与应用化学联合会（IUPAC）命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，通常被用作化工原料。近年来三聚氰胺被非法添加于食品、饲料当中，尤其用于乳制品中的蛋白造假。摄入三聚氰胺可能导致生殖损害和肾结石，甚至进一步导致膀胱癌。为保障食品安全和消费者身体健康，2011年农业部、卫生部等5部门联合发布《关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告》，明确规定三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加剂，禁止人为添加到食品中，并制定我国三聚氰胺在食品中的限量值，其中婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值限定为1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。

目前针对三聚氰胺的检测主要采用仪器检测的方法。主要方法有：高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）和气相色谱法-质谱联用法（GC-MS）等。虽然这些仪器方法具有准确度高、重复性好、适用于定量检测等优点，但设备价格昂贵，且方法操作复杂，需受过专门训练的人员才能操作，难以进行样品的大规模筛选，生产实践中的推广受到一定的限制。

免疫检测方法以其灵敏、特异、快速、简便的优点在药物残留检测领域已被广泛应用，相比仪器检测法具有很多优势。关于三聚氰胺免疫检测方法，目前已有公开专利，如吴小平等《一种三聚氰胺半抗原与抗原及其制备方法与应用》（专利申请号：200910085644.4），雷红涛等《氰脲三酰胺半抗原、抗原和抗体制备方法及应用》（专利申请号：200910038375.6）。其中，非均相的酶联免疫吸附测定法（ELISA）以其高效、低成本和高灵敏的优势在食品安全检测领域广泛应用，市面已可见各种商品化三聚氰胺ELISA快速检测的试剂盒。但是该检测方法为多步反应，每反应一步都需要分离反应结合物和未反应的试剂，反应步骤繁琐、需要反复洗涤，操作非常繁琐耗时。因此，有必要针对三聚氰胺研究提供一种快速、简便的的高通量均相检测方法，能够一步完成三聚氰胺的检测分析，以满足和适应三聚氰胺的实际应用检测要求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有三聚氰胺免疫检测技术中操作复杂、耗时等技术不足，建立一种三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫检测方法，整个检测过程只需要一步，操作简单。

本发明另一目的是提供所述检测方法的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫检测方法，是将待检样品和单试剂免疫复合物混合置换反应，测量荧光偏振值，根据标准曲线定量计算出待检样品中三聚氰胺的浓度。

本发明选择合适的三聚氰胺半抗原与异硫氰酸荧光素乙二胺衍生物偶联，合成三聚氰胺荧光示踪物活性产物，将三聚氰胺荧光示踪物活性产物和三聚氰胺抗体混合反应，制备得到一种稳定的单试剂免疫复合物；检测的时候将待检样品和单试剂免疫复合物混合后经过短时间的置换反应，测量荧光偏振值，根据标准曲线定量计算出待检样品中三聚氰胺的浓度。

所述三聚氰胺半抗原，优选具有式（Ⅰ）所示结构： 

（Ⅰ）

所述异硫氰酸荧光素乙二胺衍生物优选具有式（Ⅱ）所示结构： 

（Ⅱ）

所述三聚氰胺荧光示踪物活性产物优选具有式（Ⅲ）所示结构： 

（Ⅲ）

    所述单试剂免疫复合物的制备方法是将三聚氰胺半抗原与异硫氰酸荧光素乙二胺衍生物偶联，合成三聚氰胺荧光示踪物活性产物；将三聚氰胺荧光示踪物活性产物和三聚氰胺抗体混合反应，制备得到单试剂免疫复合物，贮存于4℃，备用；

优选地，所述三聚氰胺荧光示踪物活性产物与三聚氰胺抗体混合反应是在室温下混合反应1～15分钟，更为优选反应12分钟，即得所得单试剂免疫复合物，贮存于4℃，使用时取出即可用于检测；所述单试剂免疫复合物可以在4℃下至少可稳定保存1个月以上。

所述三聚氰胺荧光示踪物活性产物与三聚氰胺抗体的用量比例优选体积比为1:1。