[发明专利]特异性识别链霉素的DNA适配体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及对链霉素特异性的新型识别元件-DNA适配体（Aptamer）的筛选及其应用，涉及生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。

背景技术

氨基糖苷类抗生素，如链霉素、庆大霉素、新霉素、双氢链霉素等，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，可以有效抑制细菌的生长和繁殖，因此是目前我国农业、畜牧业和水产业中常用的兽药之一。但是该类抗生素的主要毒副作用体现为对于脑神经、听觉以及肾脏的损害，因此，针对该类药物在食品中的残留，许多国家和机构都规定了明确的最大残留限量(MRIJs)。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，食品中氨基糖苷类抗生素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。美国、加拿大等国官方机构调查发现链霉素是仅次于青霉素的最常在动物中残留超标的药物。因此，加大对药物残留的监控力度，加强药残检测新技术的开发，特别是研究建立特异性强、灵敏度高、高效快速的链霉素残留的检测方法，对于食品安全控制及质量体系与国际标准接轨具有十分重要的意义。

目前链霉素等氨基糖苷类抗生素的检测方法主要包括微生物法、仪器分析法和免疫分析方法等。微生物检测法是根据抗生素对特异微生物的抑制作用，来定性或定量检测受检样品中残留的抗生素的方法，该方法应用较为广泛，其优点是费用低，一般实验室都能操作，但测定时间长，结果误差较大，操作复杂，因此不能适应高通量高灵敏定量检测的需求。仪器检验方法是利用抗生素分子结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，包括气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法（CE）及各种联用技术等。此类方法灵敏度高，准确性好，但往往设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高，分析费时而不易推广。免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质，在食品抗生素残留检测领域已较为广泛地应用。酶联免疫吸附测定（ELISA）将抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合，有效保证分析中的高选择性和高灵敏度，报道最多的是免疫分析方法。目前欧美已有一些公司生产针对抗生素残留检测的ELISA 试剂盒产品，不过价格昂贵，酶标抗体的种类有限，只能检测少数种类常见的抗生素残留。由于链霉素是小分子化合物，本身不具有免疫原性，需将其与生物大分子如蛋白质连接后作为载体的抗原决定簇刺激动物才能产生特异性抗体，生产与应用存在较多的限制，包括：抗原制备中免疫原性弱的抗生素半抗原难以产生高效价的抗体；产生于鼠、兔等动物的异源抗体在使用中有可能产生非特异性反应（假阳性）；抗体的制备成本高，费时费力，克隆株不易保存；批间质量不一；抗体的活性难以长时间保持，对温度敏感，易发生不可逆变性。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在链霉素检测中的应用。

随着DNA 结合蛋白研究的深入，受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，Tuerk和Gold构建了一种研究核酸结构、功能及进化的有效方法——指数富集配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）。该技术是建立随机寡核苷酸文库，并在体外筛选能与各种配体特异性结合的寡聚核苷酸片段的一项新组合化学技术，该技术对靶分子无特殊要求，可以是蛋白质、核酸、寡肽、小分子有机物甚至是金属离子，筛选出的寡核苷酸被称为适配体。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，易于进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。链霉素等氨基糖苷类抗生素，在生物体内的自然作用靶点正是通过结合细菌核糖体，抑制细菌蛋白质的合成，因此它们与核酸类分子存在天然的亲和性。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。

本发明筛选到可以与链霉素高亲和力结合的单链DNA（ssDNA）适配体序列，为链霉素尤其是食品中链霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。

发明内容