[发明专利]一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及脊尾白虾微卫星标记的PCR检测方法，具体涉及一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法。

背景技术

微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats,SSR)是指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。多重PCR(Multiplex PCR)是在同一个反应中同时扩增两个或多个位点的聚合链式反应。它具有提高效率，避免样品浪费，快速周转时间，并可大大节约实验成本的优点。

微卫星多重PCR技术在水产动物中已有广泛应用，主要进行亲子鉴定和遗传多样性分析，Patricia Novel等已在狼鲈(Dicentrarchus labrax)、等在褐鳟(Salmo trutta)、Javier Porta等在塞内加尔鳎(Solea senegalensis)、Yan Wang等在牡蛎(Crassostrea virginica Gmelin)、GAO Huan等在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、Yutao Li等在斑节对虾（Penaeus monodon）和任宪云等在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）中有相关报道。

随着脊尾白虾人工养殖业的迅速发展，其基础研究工作近年来逐渐开展起来，截止到目前为止，脊尾白虾还未见有微卫星多重PCR体系建立等方面的技术。

发明内容

针对现有技术中脊尾白虾基础研究工作缺失，给家系建立过程中遗传参数的评估带来困难等缺点，本发明提供了一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，本发明在大量微卫星分子标记的基础上构建了3重PCR检测体系，大大缩短实验时间，提高了实验效率，所得结果可同时反映出脊尾白虾在多个微卫星位点的遗传变异。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，它包括：(1)设计并合成3重PCR引物；(2)提取基因组DNA；(3)3重PCR反应；(4)检测PCR产物；其特征在于所述3重PCR反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序，所述3重PCR反应体系的引物为EC7、EC54和EC709的组合，所述各引物序列如下：

EC007 F:AATATGCAGTGGCAAGCT；

      R:TTCCCATCATCTTCCTCC；

EC054 F:CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC；

      R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT；

EC709 F:GGCTGTCCCTTGGAACTA；

      R:ACGAAATCCGAATAACCC。

进一步的，所述3重PCR反应体系为：10×Buffer 2.0μL；25mmol/L MgCl₂1.2μL；10mmol/L dNTP 1.5μL；所述5mmol/L引物EC007:F:1.5μL+R:1.5μL、EC054:F:05μL+R:0.5μL、EC709：F:1.5μL+R:1.5μL；50ng/μL脊尾白虾基因组DNA 2.0μL；5U/μLTaq聚合酶0.2μL；ddH₂O补充至20μL。

再进一步的，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共进行25次循环；最后72℃延伸5min；4℃保存并结束反应。

其中，本发明采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、微卫星标记由于其多态性丰富、易于检测、呈孟德尔共显性遗传等优点，是进行系谱分析和群体遗传多样性研究的一种比较理想的工具，但常规PCR扩增在一个脊尾白虾检测中只能获得1~2个点位基因。本发明所述检测方法是在多个多态性微卫星标记的基础上进行标记间组合、搭配以及实验方法优化，获得更简便、快捷的PCR检测方法，大大缩短了实验时间，它与常规的PCR方法相比效率提高了3倍左右，且所得结果可同时反映出脊尾白虾在多个微卫星位点的遗传变异。