[发明专利]抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）测定试剂盒（发色底物法）

说明书

技术领域

本发明涉及医学体外诊断领域，特别涉及一种发色底物法检测抗凝血酶III的试剂盒。

背景技术

抗凝血酶III（antithrombin III，AT-III）是一种依赖于肝素的丝氨酸蛋白酶抑制剂，是一种重要的抗凝血因子，在血浆中承担着60%~70%的抗凝血酶活性，在维持血液生理性凝血与抗凝血平衡中起着重要的作用。AT-III由肝脏、血管内皮细胞和巨核细胞合成，分子量约为60000Da，属于α2-球蛋白，其基因位于第1号染色体（1p23）。

在血栓形成过程中，AT-III是一个非常重要的调节剂，在肝素的催化下，通过与凝血酶或凝血因子IXa、Xa、XIa、XIIa、纤溶酶等丝氨酸蛋白酶以1:1的比例形成复合物，从而使这些酶失去活性，发挥抗凝作用。

正常人AT-III的血浆浓度为20～30mg/dl，活性为80%～130%，波动范围相对狭窄，当血液中AT-III水平低于正常范围，则增加形成血栓的风险，是发生静脉血栓和肺栓塞的常见原因之一。血液中AT-III缺乏可由多种原因造成，如AT-III合成降低，主要见于肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期等；AT-III丢失增加，见于肾病综合症；AT-III消耗增加，见于血栓前期和血栓性疾病，如弥散性血管内凝血（DIC）、心绞痛、心肌梗死等；先天性AT-III缺陷或异常。因此，AT-III在临床诊断中是一个非常重要的指标。

目前，测定AT-III的方法主要分为三类：免疫学分析方法、凝固法和发色底物法。

免疫学分析方法是通过单向放射免疫扩散法、免疫比浊法以及酶联免疫吸附法测定样本中AT-III的浓度。这种方法比较特异和灵敏，但是操作繁琐、耗时，由于该方法在测定AT-III过程中，非活性的AT-III也参与了免疫学反应，检测的AT-III浓度并不能完全反映AT-III活性水平，这对于由于AT-III活性降低而导致的AT-III缺乏II型的病人，检出的高值结果明显是不合适的。

凝固法是通过血浆凝固时间直接或间接地测定样本中AT-III活性，主要包括一步法和两步法。一步法是将检测样本与AT-III缺乏的血浆混合，通过加入相应试剂激活外源性凝血途径或内源性凝血途径，测定凝固时间，与参考标准进行对照，从而求得AT-III的活性，该方法有多种蛋白酶参与反应，测定易受影响。两步法是将血浆通过加热进行脱纤维蛋白处理，再与过量的凝血酶孵育，残余的凝血酶活性通过测定加入血浆或纤维蛋白原后的凝固时间而换算出样本中AT-III的活性，该方法缺点在于操作比较繁琐、费时，需要将血浆加热变性进行脱纤维，从而会导致AT-III水平的降低。

发色底物法是在待测血浆中加入过量的凝血酶，在肝素存在下，凝血酶与血浆中的AT-III形成1:1复合物，剩余的凝血酶作用于底物，裂解出显色基团，显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中AT-III活性呈负相关。由于该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短，且能够适用于多种自动化分析仪器，目前，临床上已广泛应用。但是该方法也存在一定的缺陷，该法是通过加入外源性凝血酶来分析样本中AT-III活性，由于样本中也存在另一个肝素催化的凝血酶抑制剂——肝素辅助因子II（HCII），因而测定剩余凝血酶的活性是凝血酶与AT-III和HCII反应后剩余的活性，这在HCII水平正常的病人，AT-III的缺乏将有可能由于HCII的抗凝血酶活性而掩盖。因此，该法易受样本中HCII的干扰而导致AT-III的测定不准确，尤其是在AT-III缺乏的样本中。

有研究显示，在肝素存在下HCII对凝血酶的抑制作用取决于离子强度。美国专利US5646007通过提高盐的浓度，使凝血酶的构象发生变化，HCII对凝血酶测定的干扰降低，但凝血酶对发色底物的敏感度也随之降低。

Demers等人（Thrombosis and Hemostasia，69（3），pp.231-235（1993））报道采用FXa替代凝血酶，不会受到HCII的抑制，但是用FXa分析价格更加昂贵，而且FXa不太稳定，分析时需要大量稀释，不太适合自动分析仪。

发明内容

针对目前现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种发色底物法检测抗凝血酶III（AT-III）活性的试剂盒，该试剂盒抗干扰能力强、灵敏度高，具有广泛的应用前景。