[发明专利]多肽PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽发色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法。

背景技术

PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl（S-2366）的多肽部分的结构为三肽加发色基团，是一种血浆活性蛋白C（简称APC）和凝血因子XI的发色底物，该底物可用于血浆活性蛋白C活性的定量检测，在科研和临床上有着广泛的应用。

现有文献未见有关S-2366合成的报道，其他相关发色底物的合成文献中，肽键的缩合通常使用叠氮法、活性酯法、混合酸酐法等方法，反应操作较为复杂，收率不高。

精氨酸的胍基具有强亲核性和碱性，在多肽合成中须加以保护，常用的保护方法有硝基、苄氧甲酰基保护以及现在固相合成中使用较多的苯磺酰基类（如Pbf）保护等。这些保护基团在脱保护后都需要对底物肽进行盐类型的转换，转变为科研及临床上使用的盐酸盐或者醋酸盐的形式。目前转盐一般是通过过离子交换柱的方式，需要价格昂贵的离子交换介质以及很长的过柱时间，尤其是当制备量较大时更是如此。

对硝基苯胺（pNA），由于硝基的强吸电子作用，亲核性非常差，与精氨酸缩合时，一般的酰胺键合成方法效果很差，收率很低。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种高收率的PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法，该方法工艺简单、成本低，适合大批量生产。

为解决上述技术问题，本发明采用了如下方案：

PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法，包括以下步骤：

（1）以三氯氧磷为缩合剂，将氨基与胍基均带有保护基的精氨酸与对硝基苯胺缩合；所述精氨酸的胍基保护基为双叔丁氧羰基；

（2）脱除步骤（1）所得产物的氨基保护基，获得中间体1；

（3）将焦谷氨酸与羧基带保护基的脯氨酸缩合；

（4）脱除步骤（3）所得产物的羧基保护基，获得中间体2；

（5）将所述中间体1和中间体2进行缩合；

（6）以HCl或HCl和乙酸乙酯的混合物为脱保护基试剂，脱除步骤（5）所得产物的胍基保护基，获得PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl。

上述合成方法中，所述精氨酸的氨基保护基为9-芴甲氧羰基；当以9-芴甲氧羰基为氨基保护基时，步骤（2）所述氨基保护基的脱除试剂为碱。

所述脯氨酸的羧基保护基为酯，优选叔丁酯；当以酯（包括叔丁酯）为脯氨酸的羧基保护基时，步骤（4）所述羧基保护基的脱除试剂为酸。

上述合成方法中，步骤（1）的反应温度为-10℃～0℃，优选-5℃。

步骤（1）的反应溶剂为碱性有机溶剂，优选反应溶剂为吡啶。

上述合成方法中，步骤（3）和步骤（5）所述缩合反应采用碳二亚胺为缩合剂，所述碳二亚胺选自N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐，优选1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐。

当采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂时，在反应时加入HOBt，有助于减少副反应的发生，有效提高缩合效率。

本发明的优选实施路线如下：

本发明所述合成方法，具有以下特点：

（1）精氨酸与发色基团（对硝基苯胺）的缩合效率高

对硝基苯胺，由于硝基的强吸电子作用，亲核性非常差，一般的酰胺键合成方法很难缩合成功。本发明采用三氯氧磷作为缩合剂，在低温下活化精氨酸羧基，然后与对硝基苯胺发生氨解反应，15-30分钟内即能反应完全，收率在80%以上。溶剂吡啶能够催化亲核进攻反应，提高反应效率，同时能够保护酸不稳定基团（如Boc）。

（2）肽键缩合效率高

本发明的肽键缩合优选碳二亚胺型缩合试剂，具有反应条件温和、后处理简单、收率较高的特点。更优选1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合试剂，其为水溶性，在反应时加入HOBt，能够将副反应控制在很低的范围，有效提高缩合效率。

（3）精氨酸胍基保护基的脱保护工艺简单，成本低

本发明采用双叔丁氧羰基（bis-Boc）为精氨酸的胍基保护基团，在反应的最后一步，使用HCl或HCl和乙酸乙酯的混合物进行脱保护，脱保护反应温度较低，发色基团不受影响，产物直接形成底物肽的盐酸盐，省去转盐步骤，节省了制备时间和成本。