[发明专利]改进的由PiggyBac转座子介导的个体基因突变方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种改进的由piggyBac(PB)转座子介导的个体基因突变技术。 

背景技术

基因组计划是人类上世纪末实施的一项宏伟工程，通过解析控制生命活动的遗传密码和机制，逐步理解生命活动的本质。它不仅对生命科学本身产生了革命性的影响，而且将为促进人类健康和现代生物医药的产业化作出重大的贡献。随着包括人类在内的多种生物基因组DNA序列分析的完成，全面开展基因功能的研究即功能基因组学已成为生命科学的重要前沿领域[1]。 

利用基因组结构、个体发生和发育过程、组织细胞结构和功能特征等与人类相近的模式生物体系，建立动物模型，在整体生物水平研究复杂生命现象和相关未知基因的功能，已成为功能基因研究的主要技术手段。获得各种带有遗传突变的动物模型是阐述某一基因功能的直接策略。因此，X射线、化学诱变、逆转录病毒转染及转基因技术等多种产生突变的方法相继出现并被应用于基因功能研究[2-5]。但这些方法都带有不稳定性，如经常影响多个基因或引起染色体重排，或不能提供分子标记来方便地获得突变的信息[6-8]。在胚胎干细胞(ES)内利用同源重组产生特定基因突变的基因打靶技术(knockout or knockin)是目前被用来研究结构信息明确的基因功能的最重要的手段之一[9]。然而，由于同源重组几率低、动物繁育耗时费力且产生的功能失活突变(无义突变，null mutations)常常与疾病中发现的分子损伤类型不同，因此，也带有明显的局限性。 

基因捕获(gene trapping)是一种结合了随机突变可以在短期内获得大量突变物种资源、同时又兼有对突变信息可以进行比较方便、明确的突变策略，即“随机基因打靶”[10]。由于原理简单及其高效性，很快被应用于植物、昆虫、果蝇及小鼠中。基因捕获技术是通过将基因捕获载体随机整合到基因组中，产生插入失活突变，并通过设计好的筛选手段，主要是利用真核基因具有启动子和Poly A的特征，通过启动子捕获或者PolyA捕获，大量而低成本地获得突变 的细胞或者个体。由于这一技术具有的优势，它已成为一种产生大规模基因突变的便利方法，对揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值[11-13]。 

转座因子是一类在基因组内可以移动的DNA元件。利用转座子在动植物基因组内进行突变的方法已有报道[14]。piggyBac(PB)是在甘蓝环蛾中发现的一个属于第二类真核生物转座子，转座子长2,476bp，两端含有末端反向重复序列(ITR)，中间2.1kb构成一个编码转座酶的编码框。piggyBac转座子可以在基因组中切出和转座，转座位点发生在特征性的TTAA四核苷酸序列[15-17]。研究表明，piggyBac转座子在多种物种中具有转座活性，包括在昆虫、果蝇、小鼠中[18-25]。 

尽管基因捕获技术已经被大量研究应用，但还需要对这类技术加以改良，以适用于更方便、快捷地获得发生突变的生物个体，提高基因突变的成功效率，提高筛选的效率。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的由piggyBac(PB)转座子介导的个体基因突变技术。 

在本发明的第一方面，提供一种用于基因捕获的构建物，所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件： 

piggyBac转座子左臂，RNA剪接受体(SA)，启动子，报告基因，翻译终止密码子(TC)，RNA剪接供体(SD)，piggyBac转座子右臂； 

其中，所述的报告基因不带有3’端PolyA终止信号。 

在一个优选例中，所述的启动子是人巨细胞病毒启动子CMV。 

在另一优选例中，所述的构建物中，在报告基因的3’端，还包括以下依次相连的元件：Loxp，IRES，Loxp。 

在另一优选例中，所述的构建物中，在报告基因的3’端，还包括以下元件：mRNA不稳定信号；和/或KOZAK序列。 

在另一优选例中，所述的KOZAK序列为3个拷贝的KOZAK序列。 

在另一优选例中，所述的构建物中，所述的报告基因是绿色荧光蛋白基因。 

在另一优选例中，所述的构建物是载体。 

在本发明的另一方面，提供一种表达转座酶的构建物，所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件：精原细胞特异性表达启动子，piggyBac转座酶编码基因以及PolyA终止信号。