[发明专利]一种产胞外普鲁兰酶的方法及其专用微生物

说明书

技术领域

一种产胞外普鲁兰酶的方法及其专用微生物，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。

背景技术

普鲁兰多糖是麦芽三糖通过α-1,6-糖苷键连接而成的直链寡糖，而普鲁兰酶是指能够高效水解普鲁兰多糖的一类水解酶。根据普鲁兰酶对底物特异性及水解产物的种类，可以将普鲁兰酶分为4种类型：Ⅰ型普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）、II型普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）、新普鲁兰酶（EC 3.2.1.135）和异普鲁兰酶（EC 3.2.1.57）。I型普鲁兰酶可以水解普鲁兰多糖和支链寡糖中的α-1,6-糖苷键生成麦芽三糖和直链寡糖；而能水解普鲁兰多糖中的α-1,6-糖苷键同时也能水解其它多糖中的α-1,4-糖苷键的为II型普鲁兰酶；新普鲁兰酶和异普鲁兰酶作用于普鲁兰多糖中α-1,4-糖苷键分别产生潘糖和异潘糖。

由于I型普鲁兰酶对α-1，6-糖苷键的特异性及可以将最小单位的支链分解，在淀粉制糖工业中与糖化酶混合使用能最大限度地利用淀粉，因此，普鲁兰酶在以淀粉为原料的发酵工业中有着广泛的应用前景。普鲁兰酶与糖化酶并用时，在降低糖化酶用量一半的同时可以使DE值上升至高达98%，从而大大提高原料的利用率和葡萄糖的收率，例如应用在酒精工业中，可以显著提高淀粉的转化率，降低生产成本。普鲁兰酶与β-淀粉酶混合使用时，几乎可以全部将淀粉转化为麦芽糖，从而可以生产出80%以上的超高麦芽糖浆，在α-糖苷酶的作用下，超高麦芽糖浆转化为功能性异麦芽低聚糖，可以用于糖尿病人，肥胖病人以及儿童糖果中使用，有效地防止龋齿。在啤酒生产的糖化工艺中，添加普鲁兰酶可以有效地提高麦汁中可发酵性糖的含量，提高麦汁的利用率、缩短糖化时间，生产出优级干啤酒。普鲁兰酶还可以用来生产具有稳定的凝胶性能、良好的韧性和增稠作用的直链淀粉，进而利用直链淀粉生产出可生物降解的薄膜或是作为添加剂或辅料用于食品工业和纺织工业中。此外，普鲁兰酶还存在较强的反向合成能力，在高底物浓度下可以将麦芽糖基等接枝到环糊精分子上，制备得到麦芽糖基环糊精等。由于普鲁兰酶在酒精、食品、环保产业上极其重要的用途，它将和淀粉酶、糖化酶一样成为一个与国民经济发展相关的重大产业。

普鲁兰酶的生产和应用主要由诺维信和杰能科等国际公司所垄断。从20世纪60年代Bender在出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）的发酵液中发现普鲁兰酶到80年代初，普鲁兰酶的研究一直处于产酶微生物的筛选和酶学性质的鉴定方面。近几年，国际上对普鲁兰酶的研究主要集中在普鲁兰酶在革兰氏阴性细菌中的分泌机制。而国内针对普鲁兰酶的研究主要集中在普鲁兰酶生产菌的筛选、发酵优化及普鲁兰酶编码基因的异源表达等方面，筛选获得的产酶微生物主要包括产气气杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，以及高温厌氧菌、嗜热古细菌、海栖热袍菌、深海古菌等极端微生物。但是其酶活较低，一般野生菌发酵普鲁兰酶活力均低于10 U/mL，且不能有效分泌至胞外，因而很难达到工业化生产的要求。目前，尚没有通过筛选利用黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）发酵生产普鲁兰酶的报道。本发明筛选获得产胞外普鲁兰酶的菌株黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108，并通过发酵培养条件优化使该菌株产胞外普鲁兰酶的活力达到11 U/mL。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种产胞外普鲁兰酶的方法及其专用微生物。本发明目的不仅仅在于通过微生物菌株发酵生产胞外普鲁兰酶，而是通过筛选获得可以生产普鲁兰酶的新菌株，而且通过培养基成分及培养条件优化进一步提高野生菌株生产普鲁兰酶的能力，并进一步考察该菌株所产普鲁兰酶的酶学性质，以开发其生产和应用价值。

（2）技术方案

本发明首先从微生物出发，筛选能够高效生产胞外普鲁兰酶的菌株。在此基础上，对该菌种的培养基成分及培养条件进行优化，并考察以该菌种进行发酵生产的普鲁兰酶的酶学性质及水解普鲁兰的过程中产物的组成变化，进而确定普鲁兰酶的类型。

一、产胞外普鲁兰酶菌株的筛选及分类鉴定

培养基

基本培养基：支链淀粉 10 g/L，酵母粉 5 g/L，KH₂PO₄ 3 g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，NH₄Cl 2 g/L，pH 5.0。