[发明专利]一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法，特别是一种通过构建多糖指纹图谱以判定可可粉是否掺假的方法。

背景技术

可可粉具有浓烈芬芳的独特香味,含有丰富的多酚、蛋白质、碳水化合物、可可脂等多种营养元素和活性成分，是制造巧克力的重要原料，也用于生产当今世界三大嗜好性饮料之一。上个世纪90年代中期以来，随着可可制品应用范围的日趋扩大，对外贸易的拓展,我国可可加工行业发展迅猛，与此同时，国内市场上大量劣质或假冒可可粉充斥市场，不仅严重危害了食品安全，也影响了我国的国际贸易信誉和正规可可加工厂家的利益。金永生等对可可粉中掺入大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳等几种外源植物源性成分的PCR检测方法进行了探索研究，建立的方法准确性易受杂质影响，不能鉴别可可壳粉这种主要的内源性掺假物；另外，可能添加的外源植物源性成分种类繁多，难以预料，实际操作中不可能对所有可能添加的外源植物源性成分逐个进行PCR检测，因此该方法有很大局限性，难以推广。为此，本发明首次针对目前常见的使用可可壳粉掺混可可粉的现象，尝试采用超声辅助提取可可粉中多糖组分,利用硫酸水解及柱前PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)衍生化高效液相色谱法(HPLC)分析得到可可粉多糖组分的指纹图谱，再根据共有特征峰的相对峰面积，应用系统聚类分析方法成功地对掺入可可壳的可可粉进行了分析鉴别。

本发明可为我国可可粉的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科学依据与参考，从而促进我国可可粉产品的质量提高和稳定，更好地规范可可粉市场，维护消费者权益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确可靠且较简便，可推广应用于可可粉的掺假检测方法。本发明还同时提供了可可粉多糖的标准指纹图谱。

本发明的技术方案：

首先，构建可可粉多糖标准指纹图谱，包括可可粉多糖的提取、可可粉多糖的水解、可可粉多糖水解产物的PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)衍生化反应、高效液相色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定；

然后，根据可可粉标准样品多糖单糖组成的测定方法，测定模拟掺假样品的多糖单糖组成；

最后，根据可可粉标准样品和模拟掺假样品多糖单糖组成的相对峰面积组成的矩阵，进行聚类分析。

本发明的具体步骤为：

1、可可粉多糖指纹图谱的建立方法包括下列步骤：

⑴可可粉多糖的提取：称取经过索氏提取去脂的残渣700mg，置于50ml离心管中，加入25ml 80%乙醇超声提取两次，每次15min。离心（5000rmp，5min）后沉淀用无水乙醇20ml洗涤，离心，去上清液，沉淀放入培养皿中于烘箱50℃条件下干燥。称取400mg的干燥粉末，加入pH 8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液40ml，碱性蛋白酶Alcalase加酶量为5500（U/g），50℃酶解4h。100℃灭酶10min后加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜。离心（5000rpm，5min）弃上清，沉淀中再加80%乙醇，超声5min，用手振摇2min，静置，离心。沉淀用无水乙醇洗涤20ml，干燥，即得粗多糖。

⑵可可粉多糖的水解：称取粗多糖100mg，加入72%H₂SO41ml,30℃水解1h，然后稀释至2M，100℃，水解2h，水解液中加一定体积的水，用BaCO₃中和（中和至加入BaCO3后不再产生气泡，且pH为7.0），离心，上清液过滤并用水定容至5ml，备用于下述PMP衍生化。

⑶可可粉多糖水解产物的衍生化：取100μL的可可粉多糖水解产物与100μL的0.6mol/LNaOH溶液，置于1mL的离心管中混合均匀；再取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加50μL0.5mol/L的PMP(0.4355g/5mL)甲醇溶液，漩涡混匀；在70℃水浴锅中反应40min，取出放置10min冷却至室温，加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。