[发明专利]一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法

权利要求书

1.一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法，其特征在于，包括步骤：

1）构建可可粉标准品多糖标准指纹图谱，首先提取可可粉标准品多糖、对可可粉标准品多糖进行水解，随后进行可可粉标准品多糖水解产物的PMP衍生化反应、高效液相色谱的指纹分析，最终按照获得的结果绘制可可粉标准品多糖标准指纹图谱；

2）采用步骤1）的中可可粉标准样品多糖单糖组成的测定方法，测定实际送样可可粉的多糖单糖组成；

3）将步骤2）获得的结果与步骤1）中的标准指纹图谱进行相对峰面积组成的矩阵，进行聚类分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建可可粉标准品多糖标准指纹图谱的具体步骤为：

1）可可粉多糖的提取:

称取经过索氏提取去脂的残渣700mg，置于50ml离心管中，加入25ml 80%乙醇超声提取两次，每次15min；5000rmp，离心5min后沉淀用无水乙醇20ml洗涤，离心，去上清液，沉淀放入培养皿中于烘箱50℃条件下干燥；称取400mg的干燥粉末，加入pH 8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液40ml，碱性蛋白酶Alcalase加酶量为5500U/g，50℃酶解4h；100℃灭酶10min后加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜；5000rmp，离心5min后弃上清，沉淀中再加80%乙醇，超声5min，用手振摇2min，静置，离心；沉淀用无水乙醇洗涤20ml，干燥，即得粗多糖；

2）可可粉多糖的水解:

称取粗多糖100mg，加入72%H₂SO₄1ml,30℃水解1h，然后稀释至2M，100℃，水解2h，水解液中加一定体积的水，用BaCO₃中和至不再产生气泡、pH为7.0为止，离心，上清液过滤并用水定容至5ml，备用于下述PMP衍生化；

3）可可粉多糖水解产物的PMP衍生化反应:

取100μL的可可粉多糖水解液与100μL的0.6mol/LNaOH溶液，置于1mL的离心管中混合均匀；再取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加50μL0.5mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀；在70℃水浴锅中反应40min，取出放置10min冷却至室温，加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次；将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析；

4）高效液相色谱的指纹分析:

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mmi.d.，5μm；流动相：PH 6.7的0.1mol/L磷酸盐缓冲液/乙腈，体积比为83:17；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0ml/min；进样体积:20μL。在此条件下进样分析步骤(3)过滤后的PMP衍生化产物，得到可可粉多糖的高效液相色谱指纹图谱；

5）标准指纹图谱的确定:

通过11个不同产地的可可粉样品中的多糖水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有12个特征峰；所述共有特征峰以葡萄糖峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于1%。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述特征峰分别为甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖糖、岩藻糖。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中聚类分析选择组间距离作为聚类方法、欧氏距离平方法作为测量距离，以12个共有特征峰的相对峰面积组成的矩阵进行聚类分析，其中8号峰作为参照峰。