[发明专利]三七总皂苷的微生物发酵提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种三七总皂苷的微生物发酵提取法。

背景技术

三七是五加科人参属植物，拉丁学名为Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，是传统的名贵中药材。三七根中主要的有效成分是达玛烷型人参皂苷 Rb1 、Rg1、Rd、Re 和三七特有皂苷R1，以及少量的人参皂苷Rg2 、Rh1等20多种皂苷成分。现代药理学研究发现，三七总皂苷和其中的部分单体皂苷在血液、心脑血管及神经系统、物质代谢、抗炎、抗氧化及抗肿瘤等方面均有较好的活性。

大量研究表明，人参皂苷经口服后，在体内逐级代谢为次级苷，最后代谢为苷元，这些次级苷和苷元由于脱去糖基，极性减小，脂溶性增加，作为稀有皂苷才是在体内真正发挥药理作用的物质。而人参皂苷抗肿瘤活性的构效关系研究也表明：低糖链的皂苷及苷元具有较强的抗肿瘤作用。因此探究有效的方法从植物中提取出活性成分，并研究合适的方法实现稀有人参皂苷的生物转化具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种反应条件温和、提取效率高、能增加稀有皂苷成分提取量的三七总皂苷的微生物发酵提取方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种三七总皂苷的微生物发酵提取方法，包括以下步骤：

1）、微生物固态发酵：

将三七根粉与作为营养辅料的麸皮按1.5~4:1的重量比混合后作为发酵基质，将发酵基质进行灭菌，得灭菌后发酵基质；

将pH=7~8、且浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行灭菌，得灭菌后磷酸盐缓冲溶液；

按照每g发酵基质配用1~1.4ml的pH=7~8、且浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液的比例；在灭菌后发酵基质中加入灭菌后磷酸盐缓冲溶液，得发酵底物；

然后在无菌条件下进行以下操作：

按照每g发酵基质配用0.1~0.2 mL枯草芽孢杆菌的菌液的接种量，在发酵底物中加入枯草芽孢杆菌的菌液，搅拌均匀后，于34.8~35.2℃培养90~100h（最佳为35℃培养96h），得发酵曲；

2）、三七总皂苷的提取： 

将发酵曲用体积浓度为68~72%的乙醇溶液回流提取，乙醇溶液与步骤1）中的发酵基质的用量比为：7.5~8.5ml（最佳为8ml）的乙醇溶液/g发酵基质；回流提取时间为1.2~1.8h（最佳为1.5h）；回流提取结束后，离心，分别得首次上清和残渣；

将残渣用体积浓度为68~72%的乙醇溶液回流提取，乙醇溶液与步骤1）中的发酵基质的用量比为：4.5~5.5ml（最佳为5ml）的乙醇溶液/g发酵基质；回流提取时间为1.2~1.8h（最佳为1.5h）；回流提取结束后，离心，得二次上清；

合并首次上清和二次上清，得三七总皂苷提取液。

作为本发明的三七总皂苷的微生物发酵提取方法的改进：三七根粉为三七根粉碎至能过40目筛。三七根为市售的已经经过常规干燥处理后的三七根，亦称为三七根生药，其含水率≤7%。

作为本发明的三七总皂苷的微生物发酵提取方法的进一步改进：枯草芽孢杆菌的菌液的制备方法为包括如下步骤：

①、将1 g豆粕渣与pH=7~8（最佳为 pH=7.5）、且浓度为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液28~32mL（最佳为30mL）混合，得液体种子发酵培养基，灭菌，得灭菌后液体种子发酵培养基；

②、在无菌条件下，在步骤①所得的灭菌后液体种子发酵培养基中接种1~2环的枯草芽孢杆菌，于140~160rpm、36.8~37.2℃的条件下培养22~26 h（最佳培养条件为：于150rpm、37℃的条件下培养24 h）；得枯草芽孢杆菌的菌液（即，枯草芽孢杆菌菌的悬液）。

经检测，每ml该枯草芽孢杆菌的菌液中约含有10⁷个的枯草芽孢杆菌细胞。

作为本发明的三七总皂苷的微生物发酵提取方法的进一步改进：步骤1）中：

将三七根粉与作为营养辅料的麸皮按7:3的重量比混合；

按照每g发酵基质配用1.2ml的pH=7.5、且浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液的比例；在灭菌后发酵基质中加入灭菌后磷酸盐缓冲溶液，得发酵底物；

按照每g发酵基质配用0.15 mL枯草芽孢杆菌的菌液的接种量，在发酵底物中加入枯草芽孢杆菌的菌液。

备注说明：本发明中所述的灭菌均为常规的灭菌方式，即于120~122℃灭菌18~22min。

在本发明中，乙醇溶液的最佳体积浓度为70%。