[发明专利]由万能干细胞所分化的神经上皮细胞的培养方法及培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种神经上皮细胞的分化方法及其使用的培养基，特别是指一种由万能干细胞所分化的神经上皮细胞的分化方法及其所使用的培养基。

背景技术

干细胞是指尚未完全分化，而具有自我更新能力，并可分化成两种以上成熟细胞的原始细胞。以分化能力将干细胞分类，可分为全能干细胞（totipotent stem cell）、万能干细胞（pluripotent stem cell）、多能干细胞（multipotent stem cell）及双能细胞（bipotent stem cell）；另依干细胞来源区分，则可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell）、成体干细胞（somatic stem cell）及诱导型万能干细胞（induced pluripotent stem cell；iPSC）。其中，人类胚胎干细胞属于万能干细胞，来自于未着床前囊胚时期的内细胞团块，具有万能性而可分化为各种成体细胞；另外，诱导型万能干细胞则以强制表达（enforced expression）操作的方式，将特定基因或蛋白质导入已分化的体细胞，使该体细胞被重新程式化（reprogrammed）而成为类似胚胎干细胞。

由于干细胞具有细胞分裂、再生更新的能力，也可被诱导分化成为特定组织，因此，目前许多研究学者致力于干细胞分化的研究，希望干细胞分化成为特定细胞或是组织器官后，能够具有用于人类疾病治疗或再生医学等的用途，例如：可将分化培养的多巴胺神经元用以治疗帕金森氏症、分化后的器官用于器官损伤的病人。尤其是针对神经发育、神经损伤及神经退化性疾病、或是相关药物筛检等生物医学研究，更是需要借由经干细胞分化后的神经细胞来进行。

然而成熟的神经细胞来自于神经上皮细胞，因此，如何获得大量且高纯度的神经上皮细胞就显得非常重要。许多研究学者于胚胎干细胞分化初期利用加入纤维细胞生长因子-2（FGF2）（Li,X.J.et al.,2005；Timothy et al.,2009；Xu et al.,2005；Vallier,L.et al.,2005），以悬浮培养方式进行诱导神经分化，该种分化方法虽可获得具有类神经管表现的神经上皮细胞，然所需分化时间约需十四天以上，分化出来的细胞于贴附过程还夹杂有众多非神经细胞，需以酵素及人力操作于显微镜下将神经上皮细胞挑出，才可获得高纯度的神经细胞。另有学者于干细胞分化过程加入两种smad抑制剂（smad inhibitors）（Elkabetz et al.,2008；Lee et al.,2007；Chambers et al.,2009），包括Noggin和SB431542，用以缩短神经分化时间；也有学者利用基因操作诱导分化或是利用其他细胞共同培养诱导分化等（Pankratz et al.,2007；Chambers et al.,2009），然而上述方法虽可得到神经上皮细胞，但仍无法使大部分的胚胎干细胞分化成为神经细胞，并且具有生产成本昂贵、利用病毒进行基因操作的安全疑虑及与其他细胞共同培养的不确定因素等缺点。此外，倘若所生产的神经上皮细胞夹杂有其他非神经细胞或未分化细胞等，可能会影响后续神经的分化，且此未分化万能干细胞移植入动物体内也可能变成畸胎瘤。因此，有效率分化出高纯度并表现大部分神经标记的神经上皮细胞，未来将有助于成熟神经细胞的分化，而提升临床运用的可靠性及减少使用的危险。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法。

本发明的另一目的，在于提供一种神经诱导培养基，其含有Wnt信号激动剂（Wnt-signal agonist）、转化生长因子β信号抑制剂（TGFβ-signal inhibitor）及纤维母细胞生长因子信号激动剂（FGF-signal agonist），用以使干细胞得以分化出高纯度的神经上皮细胞。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种神经诱导培养基，它包含有Wnt信号激动剂（Wnt-signal agonist）、转化因子β信号抑制剂（TGFβ-signal inhibitor）及纤维母细胞生长因子信号激动剂（FGF-signal agonist）。

如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述Wnt信号激动剂选自Wntligands和肝醣合成酶激酶-3β抑制剂（glycogen synthase kinase 3βinhibitor）如药物Bio（6-bromoindirubin-3’-oxime）中的一种或多种。