[发明专利]一种杂合木聚糖酶atxb的制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及基因工程领域中利用基因工程或蛋白质工程技术对酶分子进行改造，获得底物结合能力强、水解性能好的重组酶基因，生产重组木聚糖酶的方法。

 

背景技术

木聚糖酶具有广泛的工业应用价值(Subramaniyan S et al. 2002)。木聚糖酶应用在饲料工业中，可提高饲料（尤其是糠麸类）的营养价值，促进动物生长；在造纸和纸浆工业中，木聚糖酶的使用可减少化学漂白剂的使用量，有利于环境保护；在食品工业中，木聚糖酶可用于面包制作、果汁澄清、酿造业和制备功能性低聚木糖。但是在这些实际应用中，木聚糖酶的底物并不是单一的木聚糖而是多糖复合物。如在糠麸类饲料原料中，除了可溶性木聚糖外，还有大量的不溶性木聚糖、淀粉、木质素和纤维素等其它物质（Coughlan et al., 1993）。 因此如何提高木聚糖酶吸附在多糖复合体上尤其是不溶性木聚糖、淀粉、木质素和纤维素等上，高效发挥木聚糖酶水解性能使其适应工业应用至关重要。

在工业应用上，木聚糖酶的理想特性是同时具有较宽的最适温度和pH、良好的热稳定性和pH稳定性，以及具备较好的底物结合、水解性能，然而此类理想型的木聚糖酶很难从自然界直接获取，需要利用基因工程或蛋白质工程技术对酶分子进行改造，使木聚糖酶的性质更好适应相关产业的发展需要。

木聚糖酶是可以将木聚糖降解成低聚木糖（xylooligosaccharides, XOs）和木糖（xylose）一类水解酶的总称。根据催化结构域氨基酸同源性和疏水簇分析法，木聚糖酶属于糖苷水解酶第10和第11家族（family）。一些F/10家族木聚糖酶和纤维素酶在水解过程中，首先通过其底物结合域（木聚糖结合域、纤维素结合域）或结合位点锚定在多糖复合体上，使其催化中心更容易靠近底物，便于发挥水解功能（Kuno et al., 2000）。F/10 家族的Pseudomonas fluorescens XylA含一个催化结构域和一个木聚糖结合域，二者由一段富含丝氨酸的连接序列相连，将木聚糖结合域和连接序列分别除去后所得的截短型木聚糖酶对可溶木聚糖的水解能力无明显变化，但它们对不溶性底物的结合、水解能力显著降低（Kulkarni et al.，1999）。

国内外关于木聚糖结合域的研究报道多集中在F/10家族木聚糖酶上（Din et al.，2000；刘明启等，2003）。F/10家族木聚糖酶的木聚糖结合域可以结合不溶性木聚糖和微晶纤维素，其功能和纤维素酶的纤维素结合域类似，但绝多数G/11家族木聚糖酶不具备木聚糖结合域，因此在水解天然底物（如麦麸、稻谷和秸杆等）时，酶分子与纤维素和木质素之间存在空间位阻作用，妨碍酶分子的水解作用（Sunna et al., 2000）。木聚糖酶的进化可能是通过酶蛋白分子结构域之间的随机拼接重组而实现的（Gilkes et al., 1991；Kulkarni et al.，1999），酶蛋白分子中结构域的插入，剔除和置换都有可能导致酶蛋白结构功能的显著变化(Shen et al.，1991；Black et al.，1996；Black et al.，1997；Sunna et al.，2000; Lemos et al.，2003；Mangala et al.，2003；Latorre-Garcia et al.，2005)。因此，利用基因工程或蛋白质工程技术对酶分子进行改造，使木聚糖酶能优先吸附于纤维素上，就可使其与底物靠近，从而可以更有效地发挥水解作用。

褐色高温单孢菌木聚糖酶A（Thermomonospora fusca xylanase, tfx）是G/11家族中为数不多存在木聚糖结合域和连接序列的酶分子。褐色高温单孢菌木聚糖酶A虽然不具备水解纤维素的能力，但对其具有较高的吸附结合性能（Irwin et al.，1994）。综上所述，利用基因工程或蛋白质工程技术对酶分子进行改造，获得较强底物结合力和水解性能的杂合木聚糖酶是可行的。在饲料工业中，这种人工构建的杂合木聚糖酶兼备木聚糖酶和纤维素酶活性具有特殊优势，单胃动物日粮中纤维素酶和木聚糖酶可以协同作用提高饲料（尤其是糠麸类）消化吸收率，促进动物生长，大大降低成本，提高经济效益。

 

发明内容