[发明专利]一种检测MGMT活性的化学发光检测试剂盒及检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒及其检测方法。

（二）背景技术

O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O⁶-Methylguanine DNA-Methyltransferase，MGMT）是一种高效的DNA修复酶，能够修复化疗中烷化剂药物对肿瘤细胞DNA所造成的损伤，如果肿瘤细胞中的MGMT活性达到一定水平则可能会导致耐药性，因此，MGMT活性的高低为耐药与否提供直接信息，MGMT活性检测对评估化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。不幸的是，目前还没有一种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来测定具有重要肿瘤学价值的MGMT活性。已有大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋白表达的免疫测定并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，也因为它们不直接测定MGMT的酶学活性而可能引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。基于同位素标记底物的MGMT活性测定法只适用于实验室研究而难以被用于常规临床检验中；此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素（Melanin）等蛋白的非特异结合，引起假阳性。虽然有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来测定MGMT活性，但这个方法需要多步而费时的固相分离和反应。从临床应用和检测效率（灵敏度）的角度来看，这是个明显的缺点。

很明显，无论在肿瘤生物学的基础研究中还是在肿瘤治疗的临床实践中，都急需发展一种简单可靠的方法来特异、灵敏地测定各种肿瘤组织和细胞中的MGMT活性。

（三）发明内容

本目的是提供一种简便、特异、灵敏的MGMT活性的化学发光检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒，主要包括：

试剂1：链霉亲和素磁珠浓度为1~5mg/mL的分散液，溶剂为含有0.5%（w/w）牛血清白蛋白、1%（w/w）酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；所述链霉亲和素磁珠为表面修饰链霉亲和素的磁性微球，粒径为1~3μm，内核为四氧化三铁（Fe₃O₄）、表面带有链霉亲和素生物分子，可通过戊二醛两步法在表面带有羧基或氨基等活性基团的磁性微球以化学共价结合方式引入链霉亲和素，并以含有0.5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、1%酪蛋白的pH为7.2，0.02mol/L的磷酸缓冲液进行封闭完成

试剂2：生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物，即生物素标记的O⁶-苄基鸟嘌呤溶液，使用时以含有叠氮钠0.2g/L、BSA1.0g/L的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为5μg/mL；

试剂3：辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人MGMT特异性单克隆抗体，使用时以含有0.05%（w/w）甘油和0.2g/L的硫柳汞的防腐剂溶液稀释至浓度为2μg/mL；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液，当标记酶为过氧辣根化物酶，标记方法优选为过氧碘酸钠法；当标记酶为碱性磷酸酶，标记方法优选为戊二醛法；

试剂4：O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液，溶剂为含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；使用时配制为6个梯度浓度，分别为600、150、50、25、10、0fmol/mL；

试剂5：发光底物液，为过氧化氢-鲁米诺发光液或者AMPPD溶液；所述酶标记物的标记酶为过氧辣根化物酶时，发光底物液由A液和B液构成，发光底物液A液为过氧化氢溶液，发光底物液B液为鲁米诺溶液，使用时等体积混合；所述酶标记物的标记酶为碱性磷酸酶时，发光底物液为3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3’-羟基）苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸钠（4-methoxy-4-（3-phosphatephenyl）-spiro-（1,2-dioxetane-3,2’-admantane），AMPPD）溶液，溶剂为0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。