[发明专利]杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基基因及克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ亚基基因及Ⅱ型亚基基因，本发明还涉及杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ亚基基因及Ⅱ型亚基基因克隆方法。

背景技术

血蓝蛋白（Hemocyanin）是动物界的三大呼吸蛋白之一，主要存在于低等动物如节肢、软体动物的血液中，其活性中心结合有两个Cu⁺离子，能够可逆地结合氧气。与氧结合时，无色的Cu⁺变为蓝色的Cu²⁺，从而使血液呈现淡淡的蓝色。血蓝蛋白是一种多功能蛋白，除最主要的氧气运输功能外，还在金属离子转运、蛋白质储存、渗透压调节、蜕皮激素载体、表皮固化等方面发挥作用，尤其重要的是，近年越来越多的证据表明它还在免疫反应中发挥重要的功能，其中研究最为深入的是酚氧化酶活性。酚氧化酶是先天免疫反应中的重要免疫分子，其催化的反应及反应中产生的活性物质可以通过多种方式参与到宿主防御反应中。

杂色鲍（Haliotis diversicolor）属软体动物，腹足纲，是我国南方重要的养殖鲍品种，其肉质鲜美、营养丰富，是中华民族的传统美食。由于近年来急速膨胀的鲍养殖业及日益恶化的养殖环境，鲍病害呈现出爆发性的增长态势，对水产养殖业造成了极大损害。杂色鲍等低等动物缺少特异性免疫系统，血蓝蛋白作为其中重要的先天性免疫分子，在鲍血液中的含量非常丰富，因此血蓝蛋白在免疫防御反应中扮演着非常重要的角色。此外，由于贝类血蓝蛋白在哺乳动物体内具有很好的免疫原性，广泛用作医学免疫佐剂，但贝类血蓝蛋白基因较大，很难通过基因工程表达的方法大量生产，只能从甲壳类、贝类等活体中纯化，成本很高，因而目前在NCBI数据库中没有杂色鲍血蓝蛋白的两个亚基的核苷酸全基因序列和蛋白全序列的记载。

发明内容

本发明的第一个目的是提供杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基基因（HdHc1，Haliotis diversicolor Hemocyanin type Ⅰ gene）。

本发明的第二个目的是提供杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型亚基基因（HdHc2，Haliotis diversicolor Hemocyanin type II gene）。

本发明的第三个目的是提供杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基基因和Ⅱ型亚基基因的核苷酸全序列的克隆方法。该方法简单易操作，成本低。

完整的杂色鲍血蓝蛋白由两种亚基组成，分别由两个基因编码，命名为HdHc1和HdHc2。而血蓝蛋白具有复杂的高级结构，其酚氧化酶活性需由两种亚基组成的完整蛋白分子才能发挥出来，单独的HdHc1或者HdHc2蛋白不能发挥功能。但是，目前尚无法通过体外表达的方法生产有天然活性的血蓝蛋白，因此，本发明先从杂色鲍的血淋巴中提取分离得到一种蓝色蛋白，经质谱鉴定以及与NCBI中已知的同源鲍类的血蓝蛋白的肽段序列比对，确定所获得的蓝色蛋白具有HdHc1和HdHc2两种血蓝蛋白亚基的部分肽段序列，同时具有酚氧化酶活性，进而确定所得蛋白为完整的杂色鲍血蓝蛋白。然后，根据所得HdHc1和HdHc2部分肽段序列，及NCBI中同源性90%的欧洲瘤鲍（Haliotis tuberculata）血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基基因序列（AJ252741和AJ297475），分别设计特异性引物，进而组建杂色鲍基因组文库并从中筛选到了完整的HdHc1和HdHc2基因序列，而血蓝蛋白基因均为单拷贝，且杂色鲍基因组中没有同源基因，因此根据所获得的HdHc1和HdHc2基因序列与所得的质谱鉴定的蛋白肽段序列进行比对，从而确定所得HdHc1和HdHc2基因是杂色鲍血蓝蛋白的两个亚基基因的核苷酸全序列。

本发明提供的HdHc1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因序列全长19339 bp，其对应外显子（exon）及长度如表1所示：

表1：HdHc1核苷酸序列外显子（exon）及长度