[发明专利]结核分枝杆菌Rv3120的重组蛋白、其制备方法及其在细胞免疫诊断中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药体外诊断试剂领域，特别涉及一种新型结核病免疫标志物Rv3120的重组蛋白、其制备方法及其在细胞免疫诊断中的应用。 

背景技术

结核病由病原体——结核分枝杆菌感染机体所致，至今仍为人类重要的传染病。快速、准确的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，对于结核病的控制具有重要意义。MTB感染的诊断方法有很多，目前临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床需要；Bactec技术虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应（PCR）技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于世噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散，甚至销毁的能力，充分分挥细胞免疫的作用。目前广泛应用的结核病细胞免疫诊断技术仍依赖于皮试检测试剂---结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD）。然而PPD存在与环境分枝杆菌以及BCG疫苗株的交叉反应，所以诊断价值偏低。因而发现新的结核病细胞免疫标志物，并建立新的结核病细胞免疫诊断方法是结核病诊断所亟 需的。 

发明内容

为克服现有技术中的上述问题，本发明的一个目的是提供一种结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，通过使用pET32a质粒，在Rv3120该天然蛋白序列前面加了一段Trx·Taq和S·Taq融合标签及His·Tag纯化标签。 

所述Trx·Taq和S·Taq融合标签及His·Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQ ID NO:1中从氨基末端第1至第153位氨基酸残基序列组成。SEQ IDNO:1中从氨基末端第154至第353位氨基酸残基序列组成天然Rv3120蛋白氨基酸序列。 

本发明的另一个目的是提供一种编码上述的Rv3120重组蛋白的核苷酸序列，其具有选自下列c）、d）或e）的核苷酸序列： 

c）SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 

d）不同于SEQ ID NO:2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列； 

e）在严格杂交条件下与上述c）或d）中的序列杂交，并且编码具有所述Rv3120重组蛋白活性的核苷酸序列。 

本发明的另一个目的在于提供所述的结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA； 

（2）扩增Rv3120基因； 

（3）Rv3120基因插入表达质粒； 

（4）将构建的表达质粒转化入宿主细胞； 

（5）诱导表达蛋白Rv3120； 

（6）分离纯化诱导表达产物，得到Rv3120重组蛋白， 

其中，在制备结核分枝杆菌Rv3120基因中采用的引物为Rv3120-F和Rv3120-R，所述引物Rv3120-F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rv3120-R的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。 

本发明的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120-F的核苷酸序列为如SEQ ID No:3所示，所述Rv3120-R的核苷酸序列为如SEQ ID No:4所示。 

本发明的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白、其特异性抗体或其基因引物在制备结核病检测试剂盒中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120-F的核苷酸序列为如SEQ ID No:3所示，所述Rv3120-R的核苷酸序列为如SEQ ID No:4所示。 

本发明的另一目的在于提供一种结核病检测试剂盒，其组分中的检测抗原是所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白。 

本发明的目的是提供一种包含所述结核分枝杆菌Rv3120基因的重组质粒。