[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶活性快速测定试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种β-葡萄糖苷酶活性快速测定试剂盒及其检测方法。

技术背景

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是一类水解酶(EC 3.2.1.21)，广泛存在于各种生物体内，在生物体的生理、代谢过程中起着重要作用。近年来，人们对其催化机理、分子结构、基因序列等方面都进行了深入的研究。β-葡萄糖苷酶用途广泛，已被应用于食品、化工、生物等诸多工业生产中，取得了巨大的经济效益。

目前，β-D-葡萄糖苷酶活性检测方法有以下几种：一是Barush和Swiain法，以水杨苷为酶反应底物，酶解产物用4-氨基安替比林作显色剂，使释放出来的水杨醇显色，再用分光光度计比色测定，或者用DNS试剂测定生成的还原糖量来计算酶的活力；二是荧光法，利用伞形酮(7-羟基香豆素)与4-甲基伞形酮具有强烈荧光的特点，可以计算酶活力；三是比色法，以对-硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物进行酶解，底物水解后释放出来的对-硝基苯酚可用分光光度计比色测定。

目前，微生物和植物中糖苷酶活性分析检测以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为酶底物的比色法应用最为广泛和普遍，且该方法操作简单，快速，灵敏度高，重现性好。

如何将上述的测定原理通过对吸收波长，缓冲液类型、pH值，反应温度和时间等进行优化，制造出一种机构简单、使用方便的β-葡萄糖苷酶活力测定试剂盒是技术人员要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供了一种β-葡萄糖苷酶活性快速测定试剂盒及其检测方法，旨在解决上述问题。

一种β-葡萄糖苷酶活性定量检测试剂盒，包括R1、R2、R3和R4试剂，其中R1试剂：100-300mmol/L醋酸钠缓冲液pH5-6；R2试剂：10-20mmol/L对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)水溶液；R3试剂：200-400mmol/L碳酸钠溶液；R4试剂：10-30mmol/L对硝基苯酚储备液。其中所述的生色剂为对硝基苯酚；所述的缓冲液为醋酸缓冲液。

所述的β-葡萄糖苷酶活性定量检测试剂盒在检测β-葡萄糖苷酶发酵液酶活性中的应用。

其中，利用β-葡萄糖苷酶活性定量检测试剂盒检测β-葡萄糖苷酶的活性，包括的步骤如下：

1)样品制备：

将发酵液通过3000～5000rpm离心10～20min，所获得的上清液既是或将精制固体酶碾碎定容。

2)标准曲线的绘制：

依次移取一定量的对硝基苯酚标准贮备液，用碳酸钠溶液定容至100-200mL，配成相应浓度的对硝基苯酚标准工作液；吸取1-3mL对对硝基酚标准溶液于试管中，加入1-3mL醋酸钠缓冲液；对照的空白试管中加入1-3mL醋酸钠缓冲液；在所有的试管中加入5-10mL碳酸钠溶液，振荡，在405nm处测定吸光度OD值；绘制标准曲线图。

3)样品的检测

向制备好的发酵液或精制固体酶制剂样品溶液加入20-40μL R1缓冲液混匀并加20-30μL入蒸馏水，在40-60℃下孵育，随即加入20-40μL R2试剂，在40-60C下进行酶促反应，最后加入预冷的试剂100-200μL R3终止反应，并将反应产物在酶标仪或分光光度计上进行检测；

酶活性单位U定义：在上述反应条件下，每分钟释放出1μmol的对硝基酚所需的酶量定义为一个酶活性单位；

样品中β-葡萄糖苷酶活性(U/L)

式中：

Ax——样品酶液的吸光度OD值；

Ao——对应酶液的空白吸光度OD值；

K——对硝基酚的标准曲线的斜率；

Co——对硝基酚的标准曲的截距；

Df——稀释倍数；

V——反应添加的酶液体积L；

T——反应时间min；

X——试样β-葡萄糖苷酶的活力，U/L；

所述R1试剂为醋酸缓冲液，用于为反应提供事宜的反应条件；

所述R2试剂为对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)水溶液，pNPG的含量为5-10mmol/L，用作β-葡萄糖苷酶反应的底物；低于底物的下限5mmol/L时，会导致试剂盒的线性范围降低，吸光度变化不明显，高于10mmol/L时，会使试剂盒的成本增加，不符合试剂反应的经济效益，5-10mmol/L范围内，底物浓度越高，每分钟吸光度变化的速率越快。

所述R3试剂为碳酸钠溶液，用于终止酶促生色反应。

所述R4试剂为对硝基苯酚储备液，用于标准曲线的绘制。