[发明专利]克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法。

背景技术

甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)成员。SPCSV可与马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD（sweet potato virus disease，SPVD）。SPVD是甘薯上的毁灭性病害，通常可使甘薯减产50%～98%，甚至绝收。我国自2010年首次发现SPCSV以来，目前在全国多个甘薯种植区陆续检测到该病毒病的存在，严重威胁我国的甘薯产业。

分离克隆该病毒基因组的全长序列，进一步研究病毒基因组的结构和功能，有助于探索更有效的抗病毒基因工程途径，对于SPVD的防治具有重要意义。SPCSV的基因组为双组分单链正义RNA，基因组大小为17.6 kb左右，其基因组是已知的植物病毒中第二大的单链正义RNA病毒。分离克隆植物病毒全基因组的常规方法是首先提纯病毒，然后利用纯化病毒的RNA或感染病毒的植物叶片的总RNA进行克隆。由于SPCSV常常与多种病毒混合侵染甘薯，分离纯化极为困难，而且该病毒在甘薯体内含量很低，利用常规的克隆方法很难获得SPCSV基因组全长序列。因此，截止目前，国际上仅获得了两个SPCSV分离物的全基因组序列，国内尚未见有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一组能使扩增片段相互重叠且覆盖SPCSV基因组两条RNA近全长序列的引物对；还提供了一种简便、有效的克隆甘薯褪绿矮化病毒全基因组的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种用于克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对，包括五对引物，其核苷酸序列依次为：

RNA1-1-5'         5’-GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’

RNA1-2989-3'      5’-ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’；

RNA1-2420-5'     5’-AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’

RNA1-5596-3'     5’-GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’；

RNA1-4410-5'     5’-GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’

RNA1-8637-3'     5’-AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’；

RNA2-53-5'      5’-CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’

RNA2-5599-3'    5’-CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ；

RNA2-4440-5'     5’-ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’

RNA2-8223-3'     5’-GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ 。

一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，包括如下步骤：

（1）按照上述五组引物核苷酸序列分别合成出对应的引物；

（2）将感染SPCSV的甘薯植株种植于防虫温室内，并以其饲养烟粉虱，收集以该感染SPCSV的甘薯植株饲养至少3天的烟粉虱用液氮速冻后，置于-70℃下保存备用；

（3）取上步所得烟粉虱至少10头，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

（4）以上步所得反转录产物作为模板，分别利用上述步骤（1）所得的引物进行PCR扩增，预期扩增片段大小分别为2.9kb、3.2kb、4.2kb、5.6kb和3.8kb；

（5）用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后将PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，再将连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆；核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，测序完成后，对5个片段进行拼接，即获得SPCSV基因组全长序列。