[发明专利]克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法

权利要求书

1.一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对，包括五对引物，其核苷酸序列依次为：

RNA1-1-5'         5’-GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’

RNA1-2989-3'      5’-ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’；

RNA1-2420-5'     5’-AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’

RNA1-5596-3'     5’-GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’；

RNA1-4410-5'     5’-GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’

RNA1-8637-3'     5’-AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’；

RNA2-53-5'      5’-CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’

RNA2-5599-3'    5’-CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’；

RNA2-4440-5'     5’-ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’

RNA2-8223-3'     5’-GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ 。

2.一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，包括如下步骤：

（1）按照权利要求1所述的引物核苷酸序列合成出五对引物；

（2）将感染SPCSV的甘薯植株种植于防虫温室内，并以其饲养烟粉虱，收集以该感染SPCSV的甘薯植株饲养至少3d的烟粉虱用液氮速冻后，置于-70℃下保存备用；

（3）取上步所得烟粉虱至少10头，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

（4）以上步所得反转录产物作为模板，分别利用所述步骤（1）所得的引物进行PCR扩增，预期扩增片段大小分别为2.9kb、3.2kb、4.2kb、5.6kb和3.8kb；

（5）用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后将PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，再将连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆；核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，测序完成后，对5个片段进行拼接，即获得SPCSV基因组近全长序列。

3.根据权利要求2所述的克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，反转录的反应体系为：3.75 μL RNA 模板，2μl 5×RT buffer，0.5μL浓度为10 μmol/L的下游引物，3 μL浓度为2.5 mmol/L 的dNTPs，0.25 μL浓度为40U/μl的RNase抑制剂和0.5 μL浓度为5U/μl的AMV反转录酶；所述下游引物为RNA1-2989-3'、RNA1-5596-3'、RNA1-8637-3'、RNA2-5599-3'或RNA2-8223-3'；反转录的反应程序为：42℃反转录60min，99℃ 5min，5℃ 5min，反应后得到反转录产物。

4.根据权利要求1所述的克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，PCR的反应体系为50μl，包括：5 μL10×PCR buffer，4μL浓度为2.5 mmol/L的dNTPs，浓度为10 μmol/L 的引物各1 μL，0.5μL浓度为5U/μL的LA Taq酶，5 μl反转录产物作模板，余量为ddH₂O；所述引物为RNA1-1-5'和RNA1-2989-3'，或为RNA1-2420-5'和RNA1-5596-3'，或为RNA1-4410-5'和RNA1-8637-3'，或为RNA2-53-5' 和RNA2-5599-3'，或为RNA2-4440-5'和RNA2-8223-3'；PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，54℃退火30s，根据目的条带大小，按照1kb/min计算延伸时间，72℃延伸3～6 min，完成35个循环，最后72℃延伸10min。