[发明专利]转基因大豆分子标准样品、其建立方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及转基因大豆GTS 40-3-2的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因大豆GTS 40-3-2中的应用。

背景技术

转基因大豆40-3-2(Roundup ready)是Monsanto的产品。在7个转基因大豆品系中GTS40-3-2(Roundup Ready)是目前最多用于食品和饲料的。该品系所改变的性状为耐除草剂（草甘膦）。在不同国家被批准食用的时间分别为：美国1994年；加拿大、阿根廷、日本、荷兰、瑞士1996年；乌拉圭1997年；巴西、墨西哥1998年；俄罗斯1999年；韩国、罗马尼亚2000年；南非2001年。可供人类食用或动物饲用。

近年来，转基因作物培育技术取得突破进展，陆续推出了一批新品种，在改善农作物品质、提高产量等方面发挥了巨大作用。然而，人们对转基因食品的安全性问题存在着很多的争论。转基因作物的生态风险、可能带来的环境问题、作为食品对人体健康影响的问题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界广泛性的关注。转基因产品的安全性问题已由学术观点分歧，发展到知识产权、环境问题、经济问题甚至政治问题。欧盟和一些国家相继出台了转基因产品管理法规，我国于2002年3月开始实施《农业转基因生物安全管理条例》及其三个配套管理办法。2001年，欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出对非转基因食品只要不是有意污染，允许含有1%的转基因产品（阈值），而不用标识。日本、韩国、澳大利亚等不同国家的限量阈值不同，从1%~5%不等。

转基因食品的检测是这些旨在保护生物和生态安全、维护消费者权益、促进贸易和经济健康发展的法规和政策的基本依据，其标准化将为制订、实施和改进这些法规和政策提供有力保证。国内外转基因食品的检测研究刚刚起步，许多问题都有待解决，标准样品则是该领域尚未解决的重要问题。开展转基因成分检验标准样品的研制在保证测试结果的可比性和溯源性、保障食品安全、解决贸易争端，促进经济发展等方面均具有重要的意义。更为严峻的问题是目前国外仅有转基因大豆粉、转基因玉米粉MON810等少数几个品种的标准物质，价格非常昂贵，手续繁多，周转时间长，不能适时地满足检验检疫工作的需要；日本正在加紧研制转基因产品检测的分子参考标准物质，用于转基因产品的定量检测；2005年，国内研制成功了转基因大豆粉国家二级标准物质，填补了我国在转基因成分检测标准样品方面的空白，但转基因油菜籽、转基因玉米、转基因棉花籽等标准样品以及分子标准样品仍是空白。

发明内容

鉴于国内转基因标准样品紧缺的状况，我们研制了转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品，以及转基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR检测试剂盒，包括转基因大豆GTS 40-3-2检测基因和阳性标准对照品，本项标准样品的制备及检测试剂盒的制备完成，对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，对我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

采用PicoGreen DNA荧光定量法进行了合作定值。分别对转基因大豆GTS 40-3-2品系DNA标准样品进行了6次的重复测试。经Grubbs检验和Cochran检验，所有数据均可作为定值依据；经正态性检验，这些数据符合正态分布。

转基因大豆GTS 40-3-2品系简介

转基因大豆GTS 40-3-2所含的外源基因有：耐除草剂基因CP4EPSPS，由CaMV35S启动子和NOS终止子调控。

质粒图谱为：

本发明通过以下技术路线实现：

本发明的一方面在于：转基因大豆GTS 40-3-2标准样品，其按照如下方法制备：

①以转基因大豆GTS 40-3-2的基因组为模板，分别以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5为引物，PCR扩增，得到两个目的片段；

PCR扩增条件：94℃预变性3.0min；94℃变性0.4min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃ 5min；

②将步骤①扩增的两个目的片段通过人工合成连接在一起之后，再连入质粒载体pMD19-T中；并转化至JM109感受态细胞中，获得重组菌株；

③将步骤②获得的重组菌株提取质粒，进行测序鉴定，鉴定结果以碱基序列中包含序列SEQ ID NO：7的质粒所对应的重组菌株为阳性菌株；