[发明专利]同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及实时荧光RCA技术同步检测10种转基因玉米品系的试剂盒、及其在检测转基因玉米品系中的应用。 

背景技术

随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活。由于转基因食品所具有的潜在非安全性，为保护广大消费者的权益，满足其选择权和知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。 

目前转基因产品检测方法分为两大类： 

1、免疫学检测法 

免疫学检测法是从蛋白质水平对转基因食品进行检测，即对外源蛋白质的测定。可将其分为Western杂交、酶联免疫法（ELISA）、试纸条法和快速检测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原（antigen）抗体（antibody）之间的特异性反应来实现的。这种方法的不足在于：第一，由于抗原抗体反应的专一性，因此一种试剂盒只针对一特定转基因产物，无法高通量、快速的检测具有多种混合成分的食品样品；第二，加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些转基因食品不表达蛋白质或表达量很低或很大时，则无法进行检测。 

2、PCR检测法 

PCR检测法是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，它具有灵敏度高、特异性强、可准确定量等优点。现阶段常用的PCR技术有：定性PCR，定量竞争性PCR和实时荧光定量PCR，PCR-ELISA，巢式扩增PCR和复合扩增PCR。但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果，即检测物质本身含有转基因物而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成份。 

目前，由于我国的转基因玉米涉及到的品系种类较多，靶标、序列结构各不相同，若单一品系逐个检测则存在着检测成本高、操作繁琐的问题。为了克服上述现有技术的不足，通过研究，解决了锁式通用探针和特异引物分子设计与筛选的难题，设计、筛选了实时荧光-滚环扩增（RCA）技术检测中的锁式通用探针和特异引物分子，设计、验证了锁式探针的两臂特异序列。首次探索了锁式探针RCA技术与实时荧光PCR技术相结合，建立了实时荧光PCR-锁式通用探针滚环扩增（RCA），即：实时荧光RCA，同步检测10种转基因玉米品系的高通量、特异性、准确性、高灵敏的检测技术，填补了国内外空白。 

发明内容

本研究的目的在于提供一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法。该方法应用一种锁式探针，包括以下3个部分:5’端T1和3’端T2为检测臂,与靶标序列互补结合,可在连接酶作用 下使探针环化;P1和P2为滚环扩增的通用引物区,实现环状锁式探针的级联扩增;5’端和3’端之间的与检测无关的连接序列,或用于基因芯片的Zip区，实现探针与基因芯片上固体支持物的特异结合，锁式探针的结构如图4所示： 

如果体系中存在检测的靶序列,锁式探针的两个检测臂就能与靶序列结合,在连接酶的作用下其两个末端被连接起来,形成环化的锁式探针,由于锁式探针和靶序列的杂交会产生较为稳定的拓扑结构,因而也保证了环化探针的稳定性。环化的锁式探针可以通过通用引物进行扩增,实现检测信号的放大以及多元检测。如果体系中不存在需要检测的靶序列,线形锁式探针就不会被连接酶连接形成环化的锁式探针,也就不会被通用引物扩增。锁式探针独特的设计,满足了专化性检测的需要,而且可以结合多种扩增方式及检测标记物,适应多种检测平台。 

本发明的目的：检测未知样品中，是否含有所述的10种转基因玉米的品系中的一种或多种，即：抗虫和耐除草剂玉米Bt11、抗虫和耐除草剂玉米Bt176、抗虫和耐除草剂玉米TC1507、抗虫玉米MON810、抗虫玉米MON863、耐除草剂玉米GA21、耐除草剂玉米NK603、耐除草剂玉米T25、抗虫玉米CBH351、抗虫玉米MON89034； 

发明方案：①搜集上述10种转基因玉米的品系的特异性基因序列，并且设计了10对锁式探针，人工合成并备用。②对样品提基因组→消化基因组→与锁式探针连接→利用通用引物放大检测信号→Roche Lightcycler 480II检测系统数据分析→给出结论。 

通过滚环扩增技术与待检测样品中的靶标序列互补结合,在连接酶作用下使探针环化;进一步通过滚环扩增的通用引物区,实现环状锁式探针的级联扩增。 

本发明的技术方案有以下几方面： 

本发明的一方面在于，公开一种转基因玉米品系检测试剂盒，包括锁式探针序列SEQ ID NO：1～10中至少一种。