[发明专利]使用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽药物合成技术领域，具体涉及一种固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法。

背景技术

普兰林肽（Pramlitide，结构见式I，2-7；二硫键）是一种人工合成的胰淀素（Amylin，淀粉不溶素）类似物，其结构特征为胰淀素第25位（丙氨酸）、第28位（丝氨酸）和第29位（丝氨酸）的氨基酸分别用脯氨酸替代。它充分保留了内源性胰淀素的生理作用，克服了人胰淀素在溶液中不稳定、易水解、易凝集的物理特性。临床研究表明，普兰林肽可抑制胰高糖素的释放，延缓胃排空及抑制摄食；与胰岛素联合应用，能有效地控制血糖、减轻体重、减少胰岛素用量。普兰林肽最早由美国Amylin Pharmaceuticals公司研制，于2005年3月16号获得美国FDA批准，适用于使用胰岛素但无法达到预期疗效的I型和II型糖尿病患者的辅助治疗。

已知普兰林肽的合成可以通过固相合成法（WO-A-93/10146，US-A-5424394，CN102206266A，CN101747426A），将C端酪氨酸的羧基以共价键的形式固定在不溶性树脂上，再以此氨基酸的氨基为起点，依次缩合氨基酸，延长肽链，在树脂上完成肽链的合成后，氧化第2位和第7位半胱氨酸的巯基形成分子内二硫键，再将该肽链从树脂上切割下来并脱除侧链保护基，最终制备得到普兰林肽。很显然，对于含有37个氨基酸的普兰林肽来说，这一合成途径需要重复几十步偶联和脱保护步骤，合成路线冗长，操作工艺繁琐；且随着肽链的延长和可能存在的二级结构的影响，缩合效率越来越差，导致杂质变多且难以分离，目标产物收率极低，成本很高，不适合工业化生产。

使用固相和液相结合的片段缩合技术，适合于合成含有较长氨基酸序列的多肽，其优点在于副产物较少且易于纯化，产物纯度高。然而，片段缩合策略有时会受阻于（i）有增加消旋的危险；（ii）大的保护片段溶解度差；（iii）片段间的低缩合率并伴有副反应发生的危险。为了消除或减少消旋，一般选择Gly或Pro作为片段的C端残基，如果不能实现这一点，则选择Ala或Arg作为C端残基，因为它们不易消旋。在应用片段缩合策略时，对目标序列进行合理的分段可以大大改善结果。除了合理选择C端残基，尽量减少消旋的风险，还应考虑在固相上合成的片段的纯度要高，溶解性要好；参与缩合的片段的C端和N端残基的空间位阻要小，以提高片段间的缩合率。

普兰林肽由37个氨基酸残基组成，因而存在许多种可能的片段和缩合顺序，例如CN101824086A采用1-8（片段1），9-19（片段2），20-28（片段3），29-37（片段4）四个片段，以【（4+（3+2））+1】的顺序缩合的方法；CN102164608A（同族专利US2010/0081788A1）报道的方法与之类似，采用1-8（片段1），9-19（片段2），20-29（片段3），30-37（片段4）四个片段，从C端到N端【（（4+3）+2）+1】顺序依次缩合；CN101790535A（同族专利WO2009/00366A1）报道了采用1-12（片段1），13-24（片段2），25-37（片段3）三个片段从C端到N端顺序缩合的方法；CN102180943A则采用1-16（片段1），17-28（片段2），29-37（片段3）三个片段从C端到N端依次缩合的方法。以上片段缩合合成策略中，前两种方法中第19位Ser（C端）和第20位Ser（N端）以及第四种方法中第16位Leu（C端）和第17位Val（N端）均不是理想的断点，因为在实际操作中这些片段间的缩合效率不高；第三种方法虽然断点选择较为合适，但片段3在固相合成上纯度不佳，将影响片段缩合反应效率。

鉴于普兰林肽重要的药学应用价值，有必要提供更有效的普兰林肽合成方案，能够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的普兰林肽的制备方法，该方法能够克服现有制备方法的不足与缺陷，并适合工业化生产。

本发明中普兰林肽的制备方法，采用的是固相合成片段和片段液相缩合的组合技术。首先利用固相化学在树脂载体上合成普兰林肽的4个侧链保护的中间体片段肽：片段a（1-12），片段b（13-20），片段c（21-28），片段d（29-37），然后在液相中将侧链保护的中间体片段肽缩合，最后脱除氨基端及侧链保护基得到普兰林肽。本方法中选择了适宜的4个片段肽，通过常规固相合成法均可以高效率、高产率、高纯度的获得各个片段肽；各个片段肽在液相缩合体系中溶解度高，且参与缩合的片段的C端和N端空间位阻小，缩合产率高，产物易于纯化。