[发明专利]使用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法

权利要求书

1.一种利用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法，普兰林肽结构式如式I所示，

所述方法包括以下步骤：

(1) 利用固相化学方法，以氨基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段a：AA₂₉-AA₃₇-氨基树脂；

(2) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段b：AA₂₁-AA₂₈-三苯甲基树脂；

(3) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段c：AA₁₃-AA₂₀-三苯甲基树脂；

(4) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段d：AA₁-AA₁₂-三苯甲基树脂；

(5) 将侧链保护的肽中间体片段a、b、c、d从树脂上裂解下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽（d-c-b-a）；

(6) 脱除侧链保护肽（d-c-b-a）的氨基端保护基和侧链保护基，得到普兰林肽粗肽；

(7) 纯化后得到普兰林肽。

2.根据权利要求1 所述的方法，步骤(1)中所用的氨基树脂为9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene (Sieber Amide树脂）]或9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基乙酰甲基树脂（9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl Resin），优选Sieber Amide树脂。

3.根据权利要求1 所述的方法，步骤(2)-(4)中所用的三苯甲基树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂（CTC 树脂），氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂，优选CTC 树脂。

4.根据权利要求1 所述的方法，步骤(1)-(4)采用在树脂上依肽序逐步偶联保护氨基酸，偶联体系为DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的偶联体系。

5.根据权利要求1 所述的方法，步骤(4)合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键的环化试剂是I₂，溶剂为DMF，环化时间为1-4h，环化温度为15-25℃。

6.根据权利要求1 所述的方法，步骤(5)中所用的溶剂为NMP或DMF，缩合体系为DCC与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。

7.根据权利要求1 所述的方法，步骤(5)-(6)中脱除氨基端Fmoc保护基的方法在含有哌啶的DMF或NMP的溶液中进行。

8.根据权利要求1 所述的方法，步骤(5) 包括：

(5.1) 将片段a从树脂上裂解下来，脱除氨基端保护基；将片段b从树脂上裂解下来，二者在溶液中缩合，得到片段（b-a）；

(5.2) 脱除片段（b-a）的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的c片段在溶液中缩合，得到片段（c-b-a）；

(5.3) 脱除片段（c-b-a）的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的d片段在溶液中缩合，得到侧链保护肽（d-c-b-a）。

9.根据权利要求8 所述的方法，其中：

片段（b-a）是 

片段（c-b-a）是

片段（d-c-b-a）是

片段a、c和d中的P表示伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）或tBu保护基，优选伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）。

10.根据权利要求1所述的方法，其中：

片段a是

；

片段b是

；

片段c是

；

片段d是

片段a、c和d中的P表示伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）或tBu保护基，优选伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）；片段d中的K表示Fmoc保护基或Boc保护基，优选Boc保护基。