[发明专利]一种用于净化黄曲霉毒素样本的免疫磁性微粒及其制备和应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素样本的净化处理工艺，具体涉及一种用于净化黄曲霉毒素样本的免疫磁性微粒及其制备、应用方法。

背景技术

黄曲霉毒素(AFT)是真菌的次级代谢产物，主要由黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉产生，广泛存在土壤，动植物，各种坚果，特别是花生和核桃中。黄曲霉毒素主要有4种：即B1、B2、G1、G2，其中B1被认为是目前化学致癌物中最强的一种致癌剂和诱变剂。为了防止被AFT污染的食品进入人类消费链中，及时检测将是一种有效的手段。

目前测定黄曲霉毒素(AFT)的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法、荧光光度法、层析试纸条法、化学发光和电化学发光法等。现在应用很普遍的高校液相色谱法和酶联免疫吸附法都存在样品前处理的问题，尤其是一些样本很难处理，如坚果类、花生、谷物、中药等。现在市场上卖的免疫亲和柱价格昂贵，而且单位体积柱容量相对较低，样品处理能力有限，样品处理量也相对固定，同时柱子容易堵塞。

现有的黄曲霉毒素样品的净化方法存在以下不足：

1、存在安全很大的安全问题，提取黄曲霉毒素需要使用多种有毒、异味、易挥发的有机溶剂，同时黄曲霉毒素本身就是剧毒物质，而目前的免疫亲和柱操作比较繁琐，需要操作者的实时操作，所以存在带来很大的安全问题。

2、样品处理容量比较低而且受规格限制不能根据需要做调整。目前黄曲霉毒素免疫亲和柱多是1ml和3ml两种规格。

3、免疫亲和柱制备和样品净化操作步骤繁琐同时样品粗体要求比较高，如免疫亲和柱很容易因为样品颗粒较大而造成堵塞，同时在提取时要过0.2或0.45微米的滤膜。

4、免疫亲和柱对不同样品的净化处理效果差别比较大，有的样品回收率不到70％，如一些中药中的黄曲霉毒素。

发明内容

本发明的目的在于提供用于净化黄曲霉毒素样本的免疫磁性微粒及其制备、应用方法，以解决背景技术中黄曲霉毒素样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大的安全隐患的技术问题。

本发明的技术解决方案是：

一种用于净化黄曲霉毒素样本的免疫磁性微粒，其特殊之处在于：所述免疫磁性微粒以粒径在20nm-200nm并具有超顺磁性的磁性复合微粒为载体，黄曲霉毒素单克隆抗体为配基；磁性复合微粒末端具有有反应活性的氨基/羧基/巯基/苯异硫氰酸根(等可与蛋白质反应的)基团，或者磁性复合微粒是具有类似胶体金可与蛋白质亲和结合的性质的磁性复合微粒；磁性微粒经共价反应或亲和作用与黄曲霉毒素抗体连接；磁性复合微粒的饱和磁化强度大于30emu/g。

一种制备上述免疫磁性微粒的方法，包括以下步骤：

a.黄曲霉毒素抗体在异硫氰酸根磁性磁微粒表面固定

取磁性微粒悬液加入到离心管中，轻摇重悬；置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；加入偶联缓冲液，轻摇重悬；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清后备用；

取黄曲霉毒素抗体配制得到浓度为0.3～2mg/ml的抗体溶液，取适量加入磁性微粒中，使磁性微粒和黄曲霉毒素抗体反应浓度为0.5-5mg/mL使得抗体达到最大偶联率，在摇床中反应；反应完毕，磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液，轻摇重悬磁粒；磁性分离，弃上清，除去非特异性吸附在磁性微粒表面的黄曲霉毒素抗体，得到免疫磁性微粒粗品；

b.磁性微粒的封闭

在步骤a得到的免疫磁性微粒粗品中加入封闭剂，在摇床中反应，封闭免疫磁性微粒粗品上未与黄曲霉毒素抗体结合的位点；用清洗缓冲液多次清洗，最后悬于保存缓冲液中，2～8℃保存，即制得免疫磁性微粒。

上述制备免疫磁性微粒的方法中，偶联缓冲液优选PH 7.4的0.01～0.1M的PBS缓冲液或0.02～0.2M，pH7.0～7.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；清洗缓冲液优选含0.05％吐温的0.01～0.1M，pH 7.4的PBS或0.02～0.2M，pH7.0～7.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；封闭剂优选含5～10％脱脂奶5～10％脱脂奶或1～10％牛血清白蛋白BSA，或1～5％小牛血清，或1～5％的聚乙二醇的偶联缓冲液；保存缓冲液优选含0.1％叠氮钠和0.1％BSA的0.01～0.1M，PH 7.4的PBS缓冲液。

基于上述免疫磁性微粒的净化黄曲霉毒素样本的方法，包括以下步骤：

1)按照权利要求2所述的制备方法制得免疫磁性微粒；

2)免疫磁性微粒捕获黄曲霉毒素

a.样本中黄曲霉毒素的提取