[发明专利]一种用于净化黄曲霉毒素样本的免疫磁性微粒及其制备和应用方法

权利要求书

1.一种用于净化黄曲霉毒素样本的免疫磁性微粒，其特征在于：1)所述免疫磁性微粒以粒径在20nm～200nm并具有超顺磁性的磁性复合微粒为载体，黄曲霉毒素单克隆抗体为配基；2)磁性复合微粒末端具有有反应活性的氨基/羧基/巯基/苯异硫氰酸根基团，或者磁性复合微粒是具有类似胶体金可与蛋白质亲和结合的性质的磁性复合微粒；3)磁性微粒经共价反应或亲和作用与黄曲霉毒素抗体连接；4)磁性复合微粒的饱和磁化强度大于30emu/g。

2.一种制备如权利要求1所述免疫磁性微粒的方法，包括以下步骤：

a.黄曲霉毒素抗体在异硫氰酸根磁性磁微粒表面固定

取磁性微粒悬液加入到离心管中，轻摇重悬；置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；加入偶联缓冲液，轻摇重悬；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清后备用；

取黄曲霉毒素抗体配制得到浓度为0.3～2mg/ml的抗体溶液，取适量加入磁性微粒中，使磁性微粒和黄曲霉毒素抗体反应浓度为0.5～5mg/ml使得抗体达到最大偶联率，在摇床中反应；反应完毕，磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液，轻摇重悬磁粒；磁性分离，弃上清，除去非特异性吸附在磁性微粒表面的黄曲霉毒素抗体，得到免疫磁性微粒粗品；

b.磁性微粒的封闭

在步骤a得到的免疫磁性微粒粗品中加入封闭剂，在摇床中反应，封闭免疫磁性微粒粗品上未与黄曲霉毒素抗体结合的位点；用清洗缓冲液多次清洗，最后悬于保存缓冲液中，2～8℃保存，即制得免疫磁性微粒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述偶联缓冲液为0.01～0.1M，PH 7.0～7.6的PBS缓冲液或0.02～0.2M，pH 7.0～7.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；清洗缓冲液是含0.05％吐温的0.01～0.1M，pH 7.4的PBS缓冲液或0.02～0.2M，pH 7.0～7.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；封闭剂是含5～10％脱脂奶1～10％牛血清白蛋白BSA，或1～5％小牛血清，或1～5％的聚乙二醇的的偶联缓冲液；保存缓冲液是含0.1％叠氮钠和0.1～1％BSA的0.01～0.1M，PH 7.4的PBS缓冲液。

4.一种净化黄曲霉毒素样本的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照权利要求2所述的制备方法制得免疫磁性微粒；

2)免疫磁性微粒捕获黄曲霉毒素

a.样本中黄曲霉毒素的提取

取样本溶于甲醇-水、或者乙腈-水中，充分提取，提取液经过滤后以PBS稀释；

b.取步骤1)制得的免疫磁性微粒，磁性分离，弃上清，再加入捕获缓冲液，满足最大限度捕获样品中的黄曲霉毒素；轻摇重悬，磁性分离，弃上清；加入稀释后的黄曲霉毒素样本，在摇床中37℃，180r/min反应10～15min；免疫磁性微粒捕获黄曲霉毒素完成后，再经磁性分离，从而实现黄曲霉毒素样本的净化；去除磁性分离后的上清，沉淀即为捕获了黄曲霉毒素的免疫磁性微粒；

本步骤中采用的捕获缓冲液为pH6.5～7.6的1×PBS缓冲液；

3)磁性微粒的洗脱

向步骤2)中得到的免疫磁性微粒中加入洗脱液进行洗脱，室温震荡，磁性分离，上清即为净化后的黄曲霉毒素样本。

5.根据权利要求4所述的净化黄曲霉毒素样本的方法，其特征在于：步骤2)b中，加入稀释后的黄曲霉毒素样本，在摇床中37℃，180r/min反应10min。

6.根据权利要求4所述的净化黄曲霉毒素样本的方法，其特征在于：步骤3)中所述洗脱液采用甲醇或乙腈，免疫磁性微粒在洗脱液中的浓度为0.01～20mg/ml；室温震荡0.5～3min。