[发明专利]一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种突变型人表皮生长因子基因、蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)发现于1962 年，是一种由53 个氨基酸残基组成的单体多肽。已证实hEGF 是一种关键性的创伤愈合因子，通过与人表皮生长因子受体（EGFR）的结合，它能对上皮细胞和间质细胞产生很强的致分裂作用；促进皮肤、角膜、肺和气管上皮组织等的增殖和分化；对表皮损伤和溃疡具有卓越修复功能；临床上对肠、胃、肝等器官表面损伤的修复和再生也有显著疗效。

综上所述hEGF在医疗、美容护肤等方面有着广泛的应用前景，但是由于其自身半衰期较短等不利因素，至今尚未得到广泛的使用，利用分子手段将它进行改造已成为必然。上个世纪，我们对EGF的研究多集中于怎样获得更多的EGF。近年来，随着研究技术的进步，人们不再满足于简单的获取与利用，分子水平上的研究和改造也已开始进行。由于EGFR的过表达与多种肿瘤的发生、发展和转移有关，改造EGF以期获得EGFR拮抗剂可能成为肿瘤治疗的辅助药物；另外，由于EGF能够使细胞脱分化、促进细胞生长，因此能得到活性增强的EGF突变体也是改造的一个重要目标。

分析了EGF分子特点后我们发现：1）现在EGF的三维结构已比较清楚但是其结构和功能之间的关系并不清楚；2）EGF分子很小，核酸序列只有159bp，蛋白质水平也仅有53个氨基酸，难以进行传统改组方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种新突变型表皮生长因子基因。

本发明的另一目的是提供上述突变型表皮生长因子基因编码的蛋白。

本发明的又一目的是提供上述突变型表皮生长因子基因和蛋白的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种突变型人表皮生长因子基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该序列是在野生型EGF（表皮生长因子）核苷酸序列的119位的腺嘌呤（A）突变为胸腺嘧啶（T）的核苷酸序列。

上述突变型人表皮生长因子基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。氨基酸序列第40位的谷氨酸突变为缬氨酸，比野生型EGF蛋白比活提高了20%。

上述突变型人表皮生长因子基因的制备方法，是以天然人表皮生长因子基因和猪表皮生长因子基因为模板，进行易错PCR和交错延伸PCR，获得表皮生长因子基因的重组突变文库，连接入噬菌体载体，转化宿主菌获得噬菌体文库，经过噬菌体拯救的方法扩增该噬菌体文库，用过表达人表皮生长因子受体的细胞淘洗筛选，最终获得能与人表皮生长因子受体稳定结合的噬菌体，将所得噬菌体与宿主菌孵育、扩增，进行细胞表面受体ELISA反应，最终筛选出权利要求1所述突变型人表皮生长因子基因。

上述方法更具体的步骤如下：

（1）易错PCR：以天然hEGF基因、pEGF基因为模板，SEQ ID NO:3~6所示序列为引物，进行易错PCR扩增，扩增产物连接载体转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落用Amp-LB培养基培养筛选，提取质粒；

（2）交错延伸PCR：以质粒为模板，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6为引物进行PCR，扩增产物为模板，SEQ ID NO:3~4为引物进行第二轮PCR，所得产物为人重组表皮生长因子基因定向进化文库；

（3）噬菌体展示筛选：人重组表皮生长因子基因定向进化文库与载体pCANTAB-5E连接，转入宿主细胞，同时在转化的宿主细胞中加入辅助噬菌体M13KO7进行噬菌体拯救，获得人重组表皮生长因子基因定向进化DNA的噬菌体展示文库；

（4）用经过封闭的，可以过表达EGFR的A431细胞与人重组表皮生长因子基因定向进化DNA的噬菌体展示文库共同孵育，以大肠杆菌TG1洗脱，同时用辅助噬菌体M13KO7进行噬菌体拯救，反复淘洗4轮，得到与EGFR结合力强的人重组表皮生长因子基因定向进化DNA的噬菌体展示文库；

（5）步骤（4）所得产物与其宿主菌孵育、扩增，然后进行细胞表面受体ELISA反应，筛选出具有高受体亲和力的突变型人EGF基因。

一种突变型人表皮生长因子表达载体，是由上述突变型人表皮生长因子基因插入到载体pET32a(+)的多克隆位点构建而成。