[发明专利]一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法。 

背景技术

棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。据统计，2000—2009年我国通过国家及省级审定的棉花品种数量700多个。截止到2012年2月29日，已申请植物新品种保护的棉花品种达335个。然而，由于骨干亲本的集中使用与转基因技术在棉花育种中的大规模应用，棉花品种间的遗传差异越来越小，使得完全依赖传统的形态性状进行品种鉴别越来越困难。同时由于形态鉴定的时效性差，容易受到环境与主观因素的影响，品种多乱杂的现象难以得到有效控制。近年来，以微卫星(SSR)标记为基础的玉米、水稻等主要农作物的DNA指纹库构建已逐步开展，基于SSR标记在棉花遗传图谱构建、纯度鉴定与遗传多样性分析等方面的研究也有相关报道。但常规聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染技术的检测方法在分析的材料和位点较多时，检测工作显得费时费力，且不同胶板间数据的整合与统计是一项很繁琐的工作，数据结果的准确性也很难保证。多色荧光检测技术是以不同颜色的荧光染料标记在SSR引物的5’端，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，并通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小，大大提高检测效率的同时保证了数据的准确性，尤其适用于大规模材料的检测分析。然而，基于棉花SSR的多色荧光标记检测技术构建我国棉花品种DNA指纹库的方法还未见相关报道。 

发明内容

本发明目的是提供一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，以克服现有技术存在的上述不足。 

本发明提供的一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，包括以下步骤： 

(1)提取棉花DNA； 

(2)使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套40对核心引物分别对待测品种进行SSR-PCR检测，每对引物标记有荧光染料标记，所述核心引物的核苷酸序列如下表1所示： 

表1 

(3)将步骤(2)每对引物的扩增产物进行荧光多重PCR组合，然后进行毛细管电泳检测。 

其中，步骤(1)所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mlRNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。 

进一步地，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/ml的1μlRNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。 

本发明依据以下荧光多重PCR组合的基本原则：①组合中各引物的扩增产物片段范围不能交叉；②避开非特异扩增产物峰的相互影响；③采用五色荧光标记系统：其中，ROX红色荧光，TAMAR为黑色荧光，FAM为蓝色荧光、HEX为绿色荧光、分子量内标Liz-500为橙色；④对于扩增效率较低的引物优先使用FAM进行标记。 

本发明提供的棉花品种DNA指纹库构建方法中，每对引物的荧光标记如下表2： 

表2