[发明专利]用阳离子脂质体形成金纳米球壳构建基因药物共载体系及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及以阳离子脂质体为模板形成金纳米球壳结构，以金纳米球壳结构为载体，构建药物和基因的共载体系，所载药物为阿霉素等抗癌药物，所载基因为siRNA等。

背景技术

阳离子脂质体被比较广泛的应用于药物载体和基因载体，但是脂质体是亚稳的结构，在体液中不够稳定，在体内循环时间比较短，可以对阳离子脂质体进行修饰，改善其稳定性。

金纳米材料具有比较独特的物理化学特性，金纳米球壳结构因为表面等离子体共振效应，在近红外区吸收峰。研究者已有利用脂质体为模板，在表面沉积金，形成纳米空心球结构，并利用脂质体载盐酸阿霉素等抗癌药物，用脉冲激光照射金纳米球壳，可以达到控制药物释放的目的。

金纳米球壳也被广泛用于基因的载体，利用巯基与金的反应，将阳离子性聚合物修饰在金纳米空心球的表面，利用静电吸附效应，将基因吸附在金纳米空心球表面，从而构建基因载体，或者将需要投递的基因一端修饰上巯基，再利用巯基与金的结合作用，达到投递基因的目的。

研究表明，在肿瘤治疗过程中，基因与药物联合治疗有很好的治疗效果，构建一个基因和药物的共载体系成为药物和基因联合治疗一个重要的内容。

现在很多构建药物基因共载的方法是将药物和基因利用化学的方法接在一起，进行的化学反应的过程比较复杂，反应过后杂质不易去除，并且基因十分不稳定，操作过程，稍有不慎，会造成基因的分解；也有的研究者实现了药物和基因的共载，但是当载体携带药物和基因进入细胞后，药物和基因并不能释放到细胞质中，而药物和基因必须在细胞中能够释放才能起作用，因此需要要一个简单快捷的方法来构建一个基因和药物的共载体系，并且能够很好的实现药物和基因的释放。

此发明利用金纳米空心球构建基因和药物的共载体系是一个比较好的方法，金纳米球壳结构本身毒性小，并且具有良好的光学性能，研究已表明，近红外区的脉冲激光照射，会使球壳结构破裂，从而可以释放药物和基因。

发明内容

本发明的目的在于利用以阳离子为模板形成的金纳米球壳结构，构建一个基因药物的共载体系，为基因和药物的共投递提供一个优良载体。

本发明的原理是利用阳离子性脂质体进行载药，在脂质体溶液中加入氯金酸和还原剂，在脂质体的表面沉积一层金纳米空心球壳。将要投递的目标基因的一端修饰上巯基，再利用巯基与金的结合作用将基因接在金纳米球壳的表面，从而形成一个药物和基因的共载体系。

本发明的制备方法如下：

a.将二棕榈酰磷脂酰胆碱和单棕摘酰磷脂酰胆碱按照重量比在1：1和1:0之间进行投料，加入修饰有1,2-双(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000，1,2-双(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000的质量占总质量的5%，将上述物质溶解在磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使得磷脂浓度浓度为40-60nM，加入盐酸阿霉素，使得盐酸阿霉素浓度为5-10nM。循环冷冻融化，通过100nm的聚碳酸酯膜挤出，形成载药的阳离子脂质体；取上述制备的脂质体溶液1mL，加入7-18uL浓度为100nM氯金酸溶液，再加入10.5uL-27uL浓度为500nM的抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳结构；

b.将50nmol的单链小干扰RNA（siRNA）在pH=3.8的缓冲溶液中还原得到带巯基单链siRNA，加入到1ml金纳米球壳溶液中，在6000rpm条件下离心10分钟，在30mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸100mM、pH=7.5醋酸钠溶液中重分散三次，形成药物基因共载的金纳米球壳。

氯金酸和抗坏血酸的体积加入不同，形成的金壳厚度不同，吸收峰也不同。

本发明所载基因为带巯基的基因，可以将带有二硫键的基因还原，5′-HO-(CH2)6-SS-(CH2)6-spacer18-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2→SH-(CH2)6-spacer18-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH₂将50nmol的单链siRNA在pH=3.8的缓冲溶液中还原得到带巯基单链siRNA，加入到1ml金纳米球壳溶液中，在6000rpm条件下离心10分钟，在30mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）,100mM醋酸钠（pH=7.5）中重分散三次，形成药物基因共载的金纳米球壳；

也可以直接订做带巯基的基因，例如SH-miR-21，将带巯基的基因溶解在TE缓冲溶液中，浓度为2umol/L，按照与金纳米球壳溶液体积比在64:1与2:1的范围内混合，形成药物基因共载的金纳米球壳。