[发明专利]应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法

说明书

优先权说明

本申请案要求2011年10月25日向中国国家知识产权局提出的申请号为201110327706.5的临时申请案的优先权，所述专利申请案的说明书以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及一种病毒的培养方法，特别涉及一种应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又名奥叶兹基氏病(Aujeszky′s Disease,AD)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科中的伪狂犬病毒(PRV或ADV)引起的一种或多种动物感染的急性传染病。伪狂犬病毒可引起猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物发病，症状与狂犬病类似，其中对猪的危害最大，并且猪是唯一的自然宿主。

成年猪主要表现隐性感染，仔猪常表现发热、昏迷、神经症状，且具有高致死率。

猪以外的其它动物发病通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等症状，呈散发形式，均为致死感染。不同日龄的猪感染后其症状各异，成年猪仅表现增重减慢等轻微温和症状；种猪表现不育，公猪发生睾丸肿胀、萎缩等，种用性能降低或丧失；母猪则表现为返情、屡配不孕，妊娠母猪常表现流产、产死胎和木乃伊胎；仔猪常表现高热、食欲废绝、呼吸困难、流涎、呕吐、腹泻、震颤、神经症状，继而出现运动失调、间歇性抽搐、昏迷以至衰竭死亡。该病可进行水平传播和垂直传播，可从猪传到其它动物，也可由其它动物传染猪。本病现已成为对养猪业主要危害的传染病之一，每年给养猪业带来巨大的经济损失。

由于PRV目前尚无有效的药物治疗方法，因此，该病的预防免疫就显得更为重要。

体外培养的动物细胞有两种类型，一种是非贴壁性细胞，培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，胞体为圆形。来源于血液、淋巴组织的细胞，多数肿瘤细胞和部分转化细胞属于这一类型，其培养方式类似微生物培养方式;另一种是贴壁依赖性细胞，培养时能贴附在支持物表面生长。当细胞贴附在支持物上后，会迅速铺展，然后开始有丝分裂，进入对数生长期，数天后可长成致密的细胞单层。成纤维细胞、上皮细胞以及Vero细胞、BHK细胞、ST细胞等大多数动物细胞都属于此类型。目前我国生物制品生产上培养贴壁依赖性细胞如Veor、ST细胞等多采用传统转瓶培养或静置培养，该工艺因具有技术成熟投资量小的特点而被广泛应用，但其生产中细胞所能增殖的区域仅限于培养瓶的有限面积，培养的环境条件难以监测和控制，因此细胞密度低，而且劳动强度大，操作过程不易控制，发生污染，疫苗产量及质量受到极大限制。1967年，Van Wezal首次开发了微载体系统，创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。

微载体是直径为60-50μm的微珠。由于微载体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，大大提高了生产效率。微载体最早使用的材料是离子交换凝胶(DEAE-SephadexA-50)，轻微搅动即可悬浮于培养基中。这种载体对细胞具有一定毒性，并且对培养液PH也有一定影响。后来根据细胞生长特点，对微载体进行了改良，使其带有电荷或其它介质，更利于细胞的附着和生长。目前微载体已有葡聚糖微载体、聚苯乙烯微载体、中空玻璃微载体、交联明胶微载体、纤维素微载体、聚苯烯酞胺微载体等多种不同制造材料类型。使用较多的是Cyotdex型系列微载体(Cytodex1，Cytodex2，Cytodex3)，它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子。Cytodex1整个载体带有正电荷，用于传代细胞如Vero、CHO细胞的培养；Cytodex2仅表面带有正电荷；Cytodex3不带电荷，其外表被胶原层包裹，胶原是豚鼠皮肤的提取物，同样适于细胞的附着生长。第一个工业化应用微载体的是1980年Meignier等用于口蹄疫病毒疫苗的制造，及后来的小儿麻痹疫苗的生产制造。

采用生物反应器/微载体系统培养动物细胞，细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐分裂生长成单层细胞。该培养模式把单层培养和悬浮培养融合起来，具有以下优点:

(1)表面积/体积比大，单位体积培养细胞的产率高。如1mg Cytodex 1微载体表面积可达5-6cm²，较传统的单层细胞培养面积大大增加。

(2)改良后的微载体无毒性，其大小和表面性质更适宜细胞生长，而且具有一定的透明度，便于显微镜观察细胞生长情况。

(3)微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制，同时培养基利用率高。