[发明专利]应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法

权利要求书

1.一种利用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法，其特征在于：以生物反应器微载体培养的ST细胞作为猪伪狂犬病病毒的生产细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：具体的包括以下步骤：

（1）微载体的处理：按欲培养病毒液的终体积称取微载体适量，使微载体的终浓度为3mg/ml，放入搅拌瓶中，加入无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液，室温浸泡过夜或在37℃下作用3hr，弃去PBS溶液，再用无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液洗一次，弃去，最后加入无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液，高压灭菌，弃去搅拌瓶中的PBS，加入DMEM高糖细胞生长液，室温过夜，临用前再用上述生长液洗一次；

（2）ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：按生物反应器总体积的50-70%加入无菌的细胞培养液，且每升无菌细胞培养液中按5-7g/L的浓度加入步骤（1）处理得到的微载体，启动生物反应器，转速为40rpm，搅拌30min；取生长良好的致密单层ST细胞，用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按1×10⁵个/ml的密度接种到生物反应器中，调整转速为80rpm搅拌1-3分钟，再将转速调整为50-60rpm，反应器温度逐步调整至37℃，搅拌微载体上的细胞长满80-90%，空球率低于5%，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到1×10⁷cells/mL以上；

（3）细胞毒种的繁殖：将猪伪狂犬病病毒毒种按1-5%（V/V）比例接种到生长良好的致密单层ST细胞中，细胞70-100%病变时收获猪伪狂犬病病毒液；

（4）制苗毒液的繁殖：当微载体上的ST细胞长满80-90%，空球率低于5%，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到1×10⁷cells/mL以上时，将罐体温度调整为35℃，用正压排出罐中液体，加入PBS洗涤细胞，50-60rpm搅拌10分钟后排出罐中液体，重复洗涤2次；将步骤（3）中获得的猪伪狂犬病病毒液以感染复数为0.01MOI直接感染ST细胞，并用小牛血清维持液补足至工作体积，维持罐体温度为35℃，转速为50-60rpm，继续搅拌；

（5）收获病毒液的处理：接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50；当微载体上的细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获病毒液和微载体；病毒液和微载体经3次冻融后，离心去除细胞碎片，置-20℃保存备用。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的微载体为Cytodex-1。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的搅拌瓶使用前经过硅化处理。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：ST细胞在生物反应器的微载体中悬浮培养时控制PH为7.0，接种病毒后控制PH为7.2，PH波动为±0.1。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：ST细胞培养初期使用压缩空气调节溶氧值，控制溶氧为60%，溶氧波动为±10%；培养中后期，当细胞密度大于10⁷cells/mL时，使用氧气和氮气调节溶氧值，控制溶氧为50%，溶氧波动范围为30%-80%。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的细胞培养液为含有质量分数为6%小牛血清的DMEM培养基，所述的维持液为含有质量分数为1%小牛血清的DMEM培养基。

8.由权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的猪伪狂犬病病毒液。

9.权利要求8所述的猪伪狂犬病病毒液在制备预防猪伪狂犬病疫苗药物中的应用。