[发明专利]检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测领域，特别涉及检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法。

背景技术

花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于黑米、紫薯、葡萄、蓝莓、甘蓝等多种天然有色蔬菜和水果的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中。由于花色苷具有抗氧化、清除自由基作用、抗炎、降血脂、心血管保护、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、保肝等作用，因此添加花色苷的食品备受人们喜爱。国内外以花色苷为原料的保健食品和膳食补充剂已经开始上市，其健康功效明显。花色苷的抗氧化、清除自由基作用、减少血浆氧化型低密度脂蛋白（oxidized LDL）形成、抗肿瘤、心血管保护、抗衰老、抗炎、保肝等功效与花色苷的在不同组织细胞的生物利用率有关。目前关于花色苷研究主要集中在肠道吸收和血、尿中代谢物检测方面，但相关检测结果无法反映在其他靶细胞的生物利用情况。同时，关于花色苷在不同的靶细胞的生物利用，目前没有一种方便、敏感和准确的检测方法。因此，急需一种检测花色苷的方法，用于研究花色苷的在体内靶细胞的生物利用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，该方法操作简单，检测时间短，可检范围宽，不需要特殊设备，即能定性还能定量分析。

为实现上述目的，技术方案为：

检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，包括以下步骤：

a.用终浓度为1～200μM的花色苷处理靶细胞，得处理靶细胞；

b.将步骤a所得处理靶细胞先用PBS洗涤，再用胰蛋白酶消化，计数细胞，然后破碎细胞，最后离心收集上清液，备用；

c.将步骤b所得上清液用氮气干燥，干燥后溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，测定在最大接收波长的荧光强度；

d.准确称取花色苷，溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，配置成浓度梯度的标准液，然后测定标准液在最大接收波长的荧光强度，根据标准液浓度和荧光强度绘制标准曲线；然后根据标准曲线计算步骤c所得荧光强度的花色苷浓度，用生物利用度=花色苷浓度×样品体积计算花色苷在靶细胞的生物利用度。

本发明中，pH=3~3.5的甲醇溶液的配制方法：取分析纯甲醇溶液200mL，用浓度为1M的盐酸逐滴加入，至pH计测定溶液pH=3~3.5即得。

进一步，所述步骤a是将花色苷溶于pH=3的甲醇溶液中，然后加入靶细胞中至花色苷终浓度为1～200μM，在37℃、100%饱和湿度、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养至少1小时。

进一步，所述步骤a是用终浓度为50-200μM的花色苷处理靶细胞。

进一步，所述步骤b中，所述胰蛋白酶消化是用质量分数为0.25%～0.5%的胰蛋白酶消化；

进一步，所述破碎细胞为在功率为100W的超声破碎仪中超声至少10分钟；所述离心为在温度为4℃、12000转/分钟条件下离心10分钟。

进一步，所述步骤b中，所述胰蛋白酶消化后，破碎细胞前还包括如下步骤，离心收集收集细胞，加入1mL，pH=3.0的甲醇溶液重悬细胞，准确收集1×10⁶个细胞。

进一步，所述步骤d中，所述浓度梯度的标准液是将花色苷溶于pH=3的甲醇溶液，配制成花色苷浓度分别为0.1μM，1μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM，160μM和320μM的标准液。

进一步，所述靶细胞为血管内皮细胞，小肠上皮细胞，肝细胞或肿瘤细胞。

进一步，所述花色苷为飞燕草素或矢车菊素。

本方法的有益效果在于：本发明公开了检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，利用了花色苷的自发荧光特性，运用荧光分光光度计检测花色苷在体内靶细胞的荧光强度，经过计算得出花色苷在靶细胞的生物利用率，该方法操作简单，检测时间短，检测线性范围宽，每10⁶个细胞最低检测浓度低至0.1nmol，最高检测浓度达100nmol，结果准确性高，灵敏度高，重复性好，为进一步研究花色苷的亚细胞定位分布、生物学活性和作用机制奠定了基础，同时为利用分子修饰研制具有组织靶向性的治疗药物提供理论依据。

 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明荧光分光光度计对飞燕草素（delphinidin）的全波长扫描图。

图2为本发明飞燕草素在血管内皮细胞生物利用度。