[发明专利]一种鉴定中外猪种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用启动子区特异单倍型的不同鉴定中外猪种的方法。

背景技术

中国作为世界猪肉生产和消费大国，辽阔的地域承载了丰富的猪种资源；相对于国外猪种，中国猪种表现出生长较慢，瘦肉率较低等特点，但其高繁殖力、优良肉质和耐粗饲等优点也让国外猪种望尘莫及。中外猪种在肉质方面的差异表现与其体内脂类和类固醇的合成代谢差异具有很大关系。已有研究报道参与生物体脂质和类固醇重要合成代谢反应的电子传递蛋白Cyt b5，在中外猪种中表现出遗传多态性。因此，对电子传递蛋白Cyt b5编码基因CYB5在中外猪种的分子遗传特征研究将有助于深层次地阐释中外猪种的代谢差异并为猪种改良提供依据。

近几年，相关报道表明人类的某些疾病是由于CYB5基因发生突变而产生的，如研究发现在先天血红蛋白血症的患者中，CYB5基因的内含子1的3’端发生突变A→G，使得cDNA的剪切位点发生变化，导致16bp的cDNA缺失，从而导致了先天血红蛋白血症的发生(Giordano等，1994)；CYB5基因W27X突变会导致终止密码子提前，引起Cytb5 E48和E49氨基酸残基的丢失，从而使得17，20-裂解酶失活，导致性发育异常症(Kok等，2005)。在猪CYB5基因的研究中，目前国际上的研究主要集中在CYB5与固醇类激素代谢的关系上，而在其它方面的研究报道不多。研究发现通过PCR-SSCP CYB5基因5’非翻译区上游第八个碱基处一个G→T的突变，该突变可以显著降低CYB5蛋白的表达，进而降低公猪脂肪雄甾醇的水平，但不会引起公猪繁殖力的下降(Lin等，2005，Peacock等，2008)。以上研究及相关文献数据主要是关于CYB5基因编码区的遗传变异分析，并没有报道CYB5基因上游调控区在不同猪种间的遗传变异情况，而且迄今为止也未见利用CYB5基因启动子区特异单倍型组合对中外猪种进行遗传鉴定的研究报道。

发明内容

本发明的目的是基于对猪CYB5基因序列和诊断性SNP分析，提供一种鉴定中外猪种的方法。

本发明的另一目的是提供用于鉴定中外猪种的遗传标记及其应用。

本发明的再一目的是提供用于鉴定中外猪种的PCR引物及含有该引物的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于鉴定中外猪种的遗传标记，其位于猪CYB5基因5′启动子区上，它的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，根据该序列中SNP位点的不同来鉴定中国猪种和国外猪种，所述SNP位点为位于CYB5基因起始密码子上游-660bp、-380bp或-69bp中的一个或多个。其中，中国猪种CYB5基因启动子序列中-660bp、-380bp、-69bp处碱基分别为单碱基缺失、C、T，国外猪种CYB5基因启动子序列中-660bp、-380bp、-69bp处碱基分别为G、T、C。

本发明还提供一种鉴定中外猪种的方法，根据待测猪CYB5基因启动子的SEQ ID No.2所示序列中SNP位点的不同来鉴定中国猪种和国外猪种，所述SNP位点为位于CYB5基因起始密码子上游-660bp、-380bp或-69bp中的一个或多个。其中，中国猪种CYB5基因启动子序列中-660bp、-380bp、-69bp处碱基分别为单碱基缺失、C、T，国外猪种CYB5基因启动子序列中-660bp、-380bp、-69bp处碱基分别为G、T、C。

前述方法包括以下步骤：1)提取待测猪的基因组DNA；2)以待测猪的基因组DNA为模版，利用特异性引物对扩增包括待测猪CYB5基因启动子序列中不同SNP位点的片段；其中，所述SNP位点为位于CYB5基因起始密码子上游-660bp、-380bp或-69bp中一个或多个；3)检测PCR扩增产物。

前述方法中，步骤2)中所述引物对为：

i)上游引物5’-AAGGAGGAGGTAAGCAATG-3’和下游引物5’-GAGATGAGCGGAACAGAGT-3’；或

ii)上游引物5’-TGGGTCAACAGCGAGATA-3’和下游引物5’-CCTCCGTAGAACGAGTGTA-3’；或

iii)上游引物5’-CGCCTGCCACAATGAACC-3’和下游引物5’-GCGCAGAAGGGGATGATG-3’；或

iv)上游引物5’-TGAGCGGAACAGAGTGGG-3’和下游引物5’-AATCATCGGAGGTCGTGC-3’。