[发明专利]光敏感的功能化固载相及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及寡聚核苷酸的功能化固载相，尤其涉及光敏感的功能化化合物以及用该化合物制备的光敏感的功能化固载相及其制备方法，本发明还涉及所述光敏感的功能化固载相在寡聚核苷酸固相合成和功能化中的应用，属于寡聚核苷酸的固相合成和功能化领域。

背景技术

光活性基团指在光子激发下，能够通过形成自由基或异裂中间体，发生化学变化的分子结构。它使在复杂体系中，尤其是在生理环境下，利用光控制小分子或生物大分子的变化成为可能。普遍认为，与温度、酸碱度等其它的调控手段相比，光调控具有定位准确，调控及时，对体系影响小等诸多优点。通常所指的光活性基团可分为两类，即：光异构化基团和光可切除基团。前者的光化学过程是可逆的，后者则是不可逆的化学过程。光可切除基团（caged/caging moieties）的概念最早由J.F.Hoffman于1978年提出¹，这类基团对340-370nm范围内的光敏感，能够有效地吸收这种能量的光子。最常见的光可切除基团是邻硝基苯基及其衍生物，此外还有对羟基苯乙酰氧基、香豆素类、呫吨酮乙酸类化合物等。由于邻位硝基的存在，在光激发后，邻硝基苯乙醇类化合物形成五元环状中间体，进而得到邻亚硝基苯乙酮类化合物，与化合物中的其它部分断开。由于邻硝基苯乙醇及其衍生物的结构相比其它光可切除基团在合成中或生理环境下较为稳定，因此在大多数生物体系中被广泛采用，如ATP，DNA，RNA，蛋白质，适配体等。

寡聚核苷酸可以用来做PCR引物，用于核酸序列检测的探针、等位基因特异的寡聚核苷酸分析（Allele-specific oligonucleotide，ASO）、单碱基多样性分析（Single nucleotide polymorphism，SNP）、反义寡聚核苷酸，其在分子生物学领域有广泛的应用。

近几十年来，寡聚核苷酸在分子生物学中发挥着越来越重要的作用，逐渐成为一种非常有效的研究工具。特别是近年来，相关的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸从基因水平上研究各种疾病的产生机理及其相关基因的表达网络，并使其通过调节基因的表达量来预防、诊断和治疗相关疾病，作为药物研发的另一种思路。

当寡聚物需要双标记或需要对3′内切酶稳定时，便需在3′端进行修饰。对于引入3′氨基的固相，其优点是Fmoc能在固相上选择性地脱除，从而继续在固相进行ODN的功能化缀合。同时，这种固相引入了一个手性碳原子，在HPLC纯化时可能会发现其一对光学异构的寡聚物。其不足是，尽管在寡聚物合成过程中较为稳定，但如果处理失当，某些Fmoc保护基会脱去，这样自由的氨基会与合成循环中封闭一步所用的醋酸酐发生反应，预期寡聚物的产率降低。另一种引入氨基的固相是利用邻苯二甲酰亚胺分子，使用浓氨水即可将寡聚物从固相上切下暴露氨基。这种连接臂对合成循环稳定且不存在手性中心。此外还有在固相上第一个碱基为具氨基侧链的胞嘧啶或胸腺嘧啶的氨基化方法。

对于3′巯基的修饰有二硫键保护的巯基修饰的CPG，在合成中为保证二硫键不被氧化，所有氧化步骤需使用0.2M的碘液，合成后用浓氨水从固相上切下（55℃，4小时），HPLC纯化后用TCEP水溶液断开二硫键，不需经HPLC纯化即可使用。Shankar研究组曾报告经其修饰的固相先经高氯酸汞处理，然后在THF和甲醇的混合体系中350nm光照2小时可以高于70%的收率释放固相上连接的Fmoc-氨基丙酸和胆固醇等小分子。而将固相直接暴露在日光下，7天仅释放5%。此方法可降低固相对日光的敏感度，便于操作。Greenberg等人报告称3′端为磷酸基的ODN不会被浓氨水从固相上切下，而固相上脱保护的ODN可作为杂交探针，光照后杂交后的双螺旋寡聚物即从固相切下，有错配碱基的反义链侧不能结合在固相上。

3′羟基的固相用Pd⁰在pH为5.5的环境下脱除碱基和五价磷的保护基，然后用光从固相切割下。这种方法可以在ODN中引入对浓氨水敏感或不能经合成转化而得到的非天然5-羟基胞嘧啶。用3′氨基固相合成ODN，而后光解，在液相中3′端连入芘、甾体、生物素、三肽等小分子，再脱去碱基保护基和5′-DMTr。或在固相合成后，脱DMTr保护基，5′端连入功能分子，在液相中光解后在3′端连入其它分子，最后浓氨水脱碱基保护基和乙腈氧基³⁹。这在很大程度上丰富了寡聚核苷酸缀合物的合成方法。3′羧基的功能化也有报道。