[发明专利]制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法

说明书

技术领域

本发明属于制药工程领域，具体涉及一种制备高纯度7α-甲氧基头孢菌素C(7α-Methoxycephalosporin C)的方法。

背景技术

头孢菌素类抗生素是抗感染药物中发展较早，应用较广的一大类。其中于20世纪70年代初发展起来的7α-甲氧基头孢菌素(其化学结构式如下式I)，由于在β-内酰胺环上的C7位有一个反式甲氧基，阻止内酰胺环与酶分子的接近，进而提高了药物对β-内酰胺酶的稳定性。对于这类药物的研究是最近发展比较迅速的一个前沿领域。

甲氧头孢菌素类抗生素已有多种产品上市，包括头孢米诺、头孢美唑等。这类药物共同的半合成中间体为甲氧基头孢菌素。甲氧基头孢菌素的合成一般可以通过化学合成法和微生物转化法。化学法是目前业内普遍采用的方法，主要研究方向都是以7-ACA为原料进行合成，例如中国专利CN200910075806.6报道了以7-ACA为原料，和甲巯四氮唑反应得到7-TMCA，7-TMCA和甲基硫溴进行亚胺化反应，然后与二苯重氮甲烷反应得到中间体，中间体和甲基化试剂甲基化反应，得到可以用于合成甲氧头孢类药物的中间体7-MAC。另外，中国专利CN101210019A报道了以C4，7位保护、C3位卤甲基的头孢化合物为原料，合成甲氧基头孢菌素中间体。但这些化学合成的方法普遍存在有机溶媒使用量大，能耗严重等问题。而用生物转化的方法可以有效的解决这些问题，利用生物转化得到的甲氧头孢菌素C作为合成甲氧头孢菌素类抗生素，对于清洁生产，降低能耗等方面都有显著优势。

文献(The Conversion of Cephalosporins to 7α-Methoxycephalosporins by Cell-Free Extract of Streptomyces clavuligerus.Biochem.J，1980，186：613-616)报道利用棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus，ATCC27064)细胞破碎后的粗酶液，加入辅因子和头孢菌素C底物，转化得到7α-甲氧基头孢菌素C，但是目前尚无报道从转化体系中将产物7α-甲氧基头孢菌素C分离纯化的方法。另有文献(Non-radioactive assay and HPLC analysis of cephalosporin C 7α-methocxylation by cell-free extracts of Streptomyces clavuligerus.Appl Microbiol Biotechnol，1991，35：793-797)报道化学合成7α-甲氧基头孢菌素C的方法，首先耦合α-二苯甲基-N-t-丁酮-D-α-氨基己二酯和二苯甲基-7-氨基头孢菌酸酯，得到N-t-丁酮-bis-二苯甲基酯的CPC，然后以甲醇锂盐作为甲基供体，进行添加甲氧基的反应，最后脱去羟基和氨基的保护基团，得到7α-甲氧基头孢菌素C。在化学合成过程中，使用了较多的化学试剂，反应复杂。虽然在化学合成过程中，通过有机溶剂萃取、旋蒸等步骤可以得到纯度90％以上的7α-甲氧基头孢菌素C，但是由于生物转化后体系与化学合成体系有很大差异，因而报道的分离甲氧基头孢菌素C的方法并不适用于从转化产物中纯化甲氧基头孢菌素C。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明涉及一种制备高纯度7α-甲氧基头孢菌素C的方法，该方法不仅工艺简单，能够很好的去除结构十分类似的转化底物、中间产物等杂质，且获得甲氧基头孢菌素C的收率和纯度都很高。

因此，本发明提供一种制备7α-甲氧基头孢菌素C的方法，其特征在于所述方法包括通过转化液前处理、吸附树脂层析处理和反相硅胶柱层析处理，从将头孢菌素C底物转化为7α-甲氧基头孢菌素C的转化液中制备7α-甲氧基头孢菌素C的步骤。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述方法包括下列步骤：

a)在每毫升转化液中加入30-70μl的冰醋酸混匀，使转化液中的大部分蛋白变性沉淀，抽滤取澄清的滤液，用酸调pH值为3.0-5.0，即为上柱母液；

b)将获得的上柱母液缓慢通过大孔吸附树脂层析柱；用pH为2.5-4.5的酸水洗涤柱子2-6CV(柱体积)；然后用含10％-40％(v∶v)、优选15-30％(v∶v)低脂肪醇的水溶液，2-5CV洗脱柱子，分步收集并HPLC检测流出液；将7α-甲氧基头孢菌素C HPLC纯度大于15％的收集瓶合并，调pH3.0-5.0，减压真空旋蒸浓缩获得浓缩液。