[发明专利]混合微生物核酸的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种混合微生物核酸的提取方法。

背景技术

近年来在医院内感染性疾病中不同类型病原体(如细菌与真菌、细菌与病毒、真菌或原虫与病毒)的多重感染趋于增加。多重感染严格地说，指多种病原体均是作为原发性的，且是同时发生的感染。多重感染性疾病在临床上相当常见，但由于病因复杂所以确诊甚为困难。

随着分子诊断技术的发展，使聚合酶链式反应（PCR）和探针杂交等分子生物学方法以非培养方式直接检测病原体样品成为可能。分子诊断技术的第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸的提取，这直接影响着检测的结果。

长期以来，样品中核酸的提取和纯化一直是耗时，繁琐的过程，虽然目前病毒、细菌、支原体和衣原体等病原体的的核酸提取方法和商品化的试剂盒有很多，但是这些方法的原理和操作过程各不相同，没有一个公认的可以同时对多种病原体混合物进行核酸进行高效提取的方法。因此，如何从多种病原体混合物中高效、快捷的提取核酸进行检测反应已成为了目前分子诊断技术推广和应用的一个瓶颈。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种裂解混合微生物的试剂。

本发明提供的试剂，由提取液A和提取液B组成；

所述提取液A按照如下方法制备：将Tris、EDTA、SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM；所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.05%-0.2%（体积百分含量）；所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1-0.5%（体积百分含量）；

所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为（99-98）:1:1。

所述提取液A和所述提取液B均为独立包装；

所述提取液A的pH值为7.2-7.8，所述提取液A的pH值具体为7.5；

所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7.5。

所述提取液A中，所述Tris在所述提取液A中的浓度为10mM；

所述EDTA在所述提取液A中的浓度为10mM；

所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0.1%（体积百分含量）；所述β-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0.1%（体积百分含量）；

所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98:1:1。

所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成；

所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、柯萨奇病毒（Human coxsackievirus）A16和解脲支原体（Mycoplasma urealyticum）组成。

本发明的另一个目的是提供一种裂解混合微生物提取核酸的方法，包括如下步骤：

先将所述的试剂中的所述提取液A、Carrier RNA和混合微生物混合，然后与所述的试剂中的所述提取液B混合，进行反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到混合微生物裂解液。

所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成；

所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、柯萨奇病毒（Human coxsackievirus）A16和解脲支原体（Mycoplasma urealyticum）组成。

所述提取液A、Carrier RNA和所述提取液B的配比为（200-500）μl：(5-20)μg：(200-500)μl，所述提取液A、Carrier RNA和所述提取液B的配比具体为200μl：5μg：200μl。

上述然后与所述的试剂中的所述提取液B混合的时间为2分钟，混合的方式为震荡混匀。

所述反应时间为15分钟-60分钟；所述反应时间具体为60分钟；