[发明专利]一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法。

背景技术

梨（Pyrus spp.）是世界性的重要落叶果树，我国梨树栽培面积与产量仅次于苹果和柑桔，为第三大果树，在20多个省(区、市)均有分布。采用传统育种手段，梨的许多性状已经得到了改良，但现有的梨品种在遗传上对来自生物的和非生物的胁迫以及对影响果实品质的生理病害存在着许多弱点。这些问题可通过栽培管理来缓解，但要从根本上解决问题必须依靠选配优异亲本的常规育种和分子设计育种的改良途径。与其他木本果树一样，由于梨的高度杂合性以及童期较长等特点，使常规育种周期较长。随着转基因技术的不断进展，缩短育种周期，定向引入有经济价值的外源基因已经成为可能。近年来，组织培养技术在果树快速育苗和培养无病毒苗方面均有广泛的应用。

目前，在梨组织培养方面主要存在着繁殖系数低、生根率低、叶片再生困难等问题。采用茎尖培养可以在短期内大大提高繁殖系数，还可用茎尖培养先期获得试管梢，再取其叶片作为转基因的受体材料。茎尖培养的主要目的是脱病毒和快速繁殖。梨树病毒有20余种，如苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒等，普遍危害梨树，导致产量和果实品质下降，甚至引起树体急剧衰退，提早梏死而致绝收。

国外虽然有许多关于西洋梨组织培养的文献资料，但西洋梨与我国主栽的白梨、砂梨不同，他们之间的遗传背景差异很大，无论是培养条件、对生长调节物质的需求还是植株再生的频率等均有很大区别，所以对西洋梨的研究结果并不能直接应用到我国的主栽品种中。探索适宜我国特定种类直至主栽梨品种的组培条件，并进一步完善高效、稳定的快繁及再生体系是当前急待解决的关键问题，同时也是梨树遗传转化的重要基础。梨树茎尖培养主要通过直接分化途径完成分化，并获得了完整植株，赵惠祥用‘锦丰’和‘早酥’实生苗的茎尖培养获得植株。先后有锦丰、早酥、锦香、鸭梨、秋水梨、幸水、丰水、巴梨、秋子和金花等品种培养成功。但是，存在繁殖系数低，曾云英以‘金花’梨为试材增殖倍数只能达到5.68，张玉娇以‘黄冠’梨为试材增殖倍数也只能达到5.1，这种情况下无法进行离体快繁，为了解决以上问题，完善组织培养技术体系和扩大转化品种和转化方法，我们以‘翠冠’、‘黄花’和‘早香脆’三个主要栽培品种为试材，通过梨组织培养的研究表明，三个品种在最适宜的培养条件下，增殖率均可达到100％，增值系数最高可以达到12.8，为梨大规模扩繁提供理论依据，同时建立了梨离体快繁技术体系。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法。

本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：

一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

1）外植体的准备：取带芽枝条剪成单芽茎段，消毒后去除鳞片，切取裸芽接种于诱导培养基上；所述诱导培养基成分为1/2MS+6-BA 0.8~1.2mg/L+IBA 0.05~0.3mg/L+GA1.0~3.0mg/L+20~35g/L蔗糖+3~10g/L琼脂，培养基pH值为5.8-6.0；

2）丛生芽的诱导：在诱导培养基培养10~20d待芽长到0.5~3cm，切取新梢转接到新的诱导培养基上，30-40d新芽形成并生长，每3周在相同的培养基上继代1次，50~70d获得大量丛生芽；培养过程中，光照强度1500-2000lx，光照15~18h/d，温度25-28℃；

3）继代培养：采用继代培养基进行丛生芽继代培养，每30-40d继代增殖1次；培养条件为：光照强度1500-2000lx，光照16h/d，温度25-28℃；所述丛生芽继代培养基为1/2MS+6-BA1.5mg/L+IBA 0.05~0.3mg/L+20~35g/L蔗糖+3~10g/L琼脂，培养基pH值为5.8-6.0；

4）生根培养：切取1-1.5cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上，暗处理5d后再转光下培养，培养50-60d得到生根苗；培养条件为：光照强度1500-2000lx，光照16h/d，温度25-28℃；所述生根培养基为1/2MS+IBA0.3~1.0mg/L+50~70g/L蔗糖+3~10g/L琼脂，培养基PH值为5.8-6.0。