[发明专利]一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒，特别是涉及一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒。

背景技术

动物饲料是“从农场到餐桌”食品安全链的重要环节，食用受病原菌污染饲料的动物或动物产品或导致人类疾病，因此准确、快速地检测饲料中的沙门氏菌，对于防止畜禽和人类沙门氏菌污染具有十分重要的意义。传统沙门氏菌检测方法，由于其检测周期长、漏检率高、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。实时PCR技术被应用多年，用于检测食品或饲料中的病原微生物。传统的PCR检测方法可以对沙门氏菌等特定微生物DNA的单条基因片段进行放大，放大后，特定的DNA片段被成千上万倍的复制，运用可视技术按照细菌基因序列探测和识别复制后细菌的遗传物质可以更加容易。然而，目前的PCR检测方法容易出现假阳性的结果，这造成了巨大的浪费和不必要的召回事件的发生。出现这种结果的原因是，PCR技术跟其它的DNA法一样，均不能将活的跟死的沙门氏菌区分开，因此这导致PCR技术提供了错误的结果。为了克服以上PCR技术的弱点，有效区分死细菌及活细菌，可用叠氮溴化已啶（EMA）对待检样品进行前处理，使死的沙门氏菌细胞不能进行PCR扩增，从而有效区分沙门氏菌死细胞及活细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒，成本低廉，操作方便快捷，能客观反映饲料中沙门氏菌活细胞的存在情况，可为饲料中沙门氏菌的快速、准确检测提供有效手段。

本发明采用以下技术方案：

一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下成分：沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、Taq预混酶及引物混合物、DL Marker 2000、EMA溶液和共价交联曝光装置。

进一步，所述Taq预混酶及引物混合物中，预混酶浓度为20u/mL，引物浓度为100pmol/mL，其保存条件为-20°C。

进一步，所述引物的序列为：SE-1：GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG；SE-2: CATCGCACCGTCAAAGGAAC。   

进一步，叠氮溴化已啶浓度为0.5mg/mL。

进一步，所述共价交联曝光装置包括箱体，其特征在于：所述箱体上设有活动门、卤素灯开关、紫外灯管开关和总电源开关，所述箱体内顶部设有卤素灯，箱体两侧内壁上分别设置有至少一个紫外灯管。

进一步，所述的紫外灯管为两个。

进一步，所述箱体上还设有可视窗口。

一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法，其中，包括如下步骤： 

1）将饲料样品用BPW肉汤增菌，分别吸取500ul菌悬液于四个1.5mL离心管中，其中两份作为制备好的活细胞菌悬液，两份进行100°C水浴10 min制成死细胞悬浮液。取活细胞菌悬液及死细胞菌悬液各一份，分别加入4ul 0.5mg/mL的叠氮溴化已啶溶液，摇匀，将其置于冰盒上，在共价交联装置内曝光3min。

2）对四支离心管内的菌悬液分别提取细菌DNA。

3）PCR扩增沙门氏菌invA基因：取试剂盒中预混酶及引物混合物，50ul体系吸取40ul，加入提取的细菌DNA10 ul进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，56℃退火30 sec，72℃延伸45sec，33个循环，最后72℃终延伸10 min。

4）电泳分析：将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统进行成像分析。

本发明的有益效果为：

本发明经过大量研究，研制出了用于检测饲料样品中沙门氏菌活细胞的快速检测试剂盒，采用了EMA与PCR结合技术用叠氮溴化乙锭染料对饲料样品的菌悬液进行处理，叠氮溴化乙锭在强光照的环境下进入死的细菌体内后与DNA分子进行结合，使得细菌在染色后不能被溶解，但不能穿透活细胞，因此不影响饲料中沙门氏菌活细胞的PCR扩增，但可阻断饲料中沙门氏菌死细胞的PCR扩增，这种改进的PCR技术可为饲料中沙门氏菌的快速、准确检测提供有效手段。